EIAV减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞Th1型细胞因子的转录

目的：探讨马传染性贫血病毒驴白细胞减毒疫苗免疫马后,外周血单个核细胞中Th1型细胞因子转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法：应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立了马PBMC中IFNγ-、IL-2、IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,定期观察4组（疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组、自然感染组）12匹马外周血PBMC中细胞因子的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后细胞因子转录水平的变化。结果：DLV免疫马,在免疫后3周外周血PBMC中IFN-γ、IL-2转录量显著高于阴性对照组及自然感染组（P〈0.01）;免疫后用EIAV强毒株攻击,IFNγ-、IL-2和IL-12转录的量明显升高,免疫马获得完全保护;强毒株攻击阳性对照马IFN-γ、IL-2转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论：本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IFN-γ、IL-2、IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关,此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1。这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。     

检测马白细胞介素-18双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:建立检测马白细胞介素-18(equine interleukin-18,EIL-18)的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法.方法:将识别不同表位的EIL-18的2株单克隆抗体(mAb)B1G1和S6A3纯化后,利用生物素标记试剂盒对B1G1株mAb进行标记,以重组马白细胞介素-18(rEIL-18)为捕获抗原进行ELISA检测来建立EIL-18双抗体夹心ELISA.结果:经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为4 mg/L,检测抗体的工作效价为1:2 000.建立的方法可检测马血清中的EIL-18,与猪、牛和羊血清中的IL-18不发生交叉性反应,此方法检测敏感度达到15 ng/L,特异性良好. 结论:成功建立了EIL-18的双抗体夹心ELISA,为马细胞免疫学研究提供了方法,也为下一步EIL-18 ELISA试剂盒的商品化开发奠定了坚实基础.     

柯萨奇B组3型病毒中国分离株VP4、3D基因序列及系统发生树分析

目的研究柯萨奇B组3型病毒（CVB3）中国分离株结构蛋白VP4、非结构蛋白3D基因序列及变异性。方法在HeLa细胞中增殖病毒，用RT-PCR扩增目的基因片段，与pMDl8-T载体连接，PCR初步鉴定后测序，进行序列同源性及系统发生分析。结果CVB3中国分离株VP4基因含207个碱基，编码69个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．10％；3D基因含1386个碱基，编码462个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．62％。在系统发生中，CVB3中国株VP4基因、3D基因均与Nancy株聚簇。结论CVB3中国分离株VP4和3D基因长度与Nancy株一致，进化上属同一分支。     

pLXSN-BDNF体外转染神经干细胞及其外源基因的表达

Objective To develop neural stem cells(NSCs) which can stably express exogenous brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in vitro. Methods NSCs from the subependymal zone of embry-onic day 14.5(E14.5) rat brain were purified by limiting dilution assay and then infected with supernatant of recombinant retrovirus pLXSN-BDNF and retrovirus pLXSN. The original copy numbers of exogenous gene templates from three groups NSCs(pLXSN-BDNF viral infection group, pLXSN viral infection group, control group) were detected by fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR). ELISA assay was used for determining the protein contents of BDNF of supernatant from three groups NSCs for six days continually after seeded in 24-well plates in the same cell density. Results NSCs were purified successfully by limiting dilution assay.The original copy numbers of exogenous BDNF gene templates from pLXSN-BDNF viral infection group by FQ-PCR were (19.57±0.65) × 103 copies/μl, higher than those of another two groups(P < 0.05). The protein contents of BDNF of supernatant from NSCs of pLXSN-BDNF viral infection group was highest among three groups and compared with another two groups had statistical significance (P <0.05) . Conclusion The purified NSCs can be transduced exogenous BDNF successfully with supematant of recombinant retrovir-us pLXSN-BDNF which provide experimental evidences and laying foundations for further research of retinal transplantation and quantization investigation of gene therapy for optic nerve injury.     

大动物高级别生物安全实验室设计建设要点

第二次世界大战结束后，美国出于其全球战略考虑，对各类致病微生物均表现出浓厚的研究兴趣。然而在普通实验室进行致病微生物的研究不可避免的会发生实验室感染和泄漏事件。为了防止这类事件的发生，在20世纪的五、六十年代，美国出现了最早的生物安全实验室。随后其他国家，如前苏联、英国、法国、德国、日本、澳大利亚、瑞典、加拿大、西班牙、南非、加蓬、瑞士、荷兰、丹麦、新加坡、马来西亚等国也相继建造了不同级别的生物安全实验室。     

新型冠状病毒动物实验存在暴露风险时的实验室生物安全要求

解读了GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》标准中关于生物安全实验室的分级和分类,阐明了缓冲间和气锁的定义,重点分析了4.4.3类型实验室关于准入和退出,气压、压差和气密性及送排风高效空气过滤器等技术性条款。指出了4.4.3类型实验室开展不传染人的非洲猪瘟病毒实验活动和可传染人的新型冠状病毒实验活动时关于个体防护用品选择及其处置中存在的问题,以及风险评估应重点考虑的要素,建议组织国家病原微生物实验室生物安全专家委员会对新型冠状病毒进行论证,明确新型冠状病毒动物实验存在暴露风险时的实验室生物安全要求。     

人分化抑制因子Id-2基因在大肠埃希氏菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达人Id-2与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-2的多克隆抗体.方法 从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增Id-2基因的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-ld-2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-2融合蛋白,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性,并以此为抗原制备多克隆抗体.结果 经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-2基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量40 000的GST-Id-2融合蛋白.Western-Blot、ELISA和琼脂双向扩散实验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-2特异性反应.结论 Id-2基因在在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-2及其在各种组织中的表达提供了一种检测方法,也为分析Id-2分子结构及抗原表位奠定了基础.     

pLXSN-BDNF体外转染神经干细胞及其外源基因的表达

目的 建立体外稳定表达脑源性神经生长因子(BDNF)的神经干细胞(NSCs).方法 采用有限稀释法纯化体外培养的NSCs.用重组和空白逆转录病毒感染NSCs,分别采用荧光定量PCR法和ELISA法检测3组(pLXSN-BDNF病毒感染组、pLXSN病毒感染组、空白对照组)NSCs中外源基因的表达水平.结果 荧光定量PCR法测定pLXSN-BDNF组BDNF原始模板拷贝数为(19.57±0.65)×10~3copies/μl,与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法测定pLXSN-BDNF组NSCs细胞上清中BDNF含量最高,与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 用携带BDNF的重组逆转录病毒能成功地将外源基因导入NSCs中,为NSCs眼内移植研究,也为基因治疗视神经损伤的量化研究提供实验依据.     

EIAV减毒疫苗免疫后马外周血单个核细胞中IFN-γ的转录

目的:探讨马传染性贫血病毒(Equineinfectiousa-nemiavirus,EIAV)驴白细胞减毒疫苗(DLV)免疫马后,外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γmRNA转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法:应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立马PBMC中IFN-γmRNA转录水平的定量检测方法,在不同时间点定期观察4组(疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组及EIAV自然感染组)12匹马PBMC中IFN-γmRNA的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后IFN-γmRNA转录水平的变化。结果:疫苗免疫马在免疫期内,PBMC中IFN-γmRNA转录的量显著高于阴性对照组及自然感染组(P<0.01)。免疫后用EIAV强毒株攻击,IFN-γ转录的量继续升高,4匹免疫马均获得完全保护;强毒株阳性对照组IFN-γmRNA转录的量随疾病的进展波动,发热期明显下降。结论:本研究首次证明,EIAV减毒疫苗可诱导马PBMC中IFN-γ基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关。此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。