体外培养版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞的生物学特性

目的　分离培养成年版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法　成年版纳微型猪骨髓基质干细胞通过密度梯度离心法分离获得 ,用含 15 %小牛血清的 DMEM在 37℃ ,5 % CO2 条件下培养 ;通过克隆生长特性、特异抗原表达和成骨分化能力鉴定其干细胞特性。结果　版纳微型猪近交系骨髓分离获得的基质干细胞具有多种形状 ,但主要为梭形。其具有很强的增殖能力 ,在体外培养条件下可以观察到明显的克隆样生长 ;表达 SH2、SH3、SH4、SB10和 SB2 1等骨髓基质干细胞的特异标记 ;经成骨添加剂诱导培养之后能分化为成骨细胞 ,碱性磷酸酶活性增强并具有细胞外基质矿化能力。结论　成年版纳微型猪近交系骨髓来源的基质干细胞具有干细胞的一般生物学特性     

成骨分化的骨髓间充质干细胞的免疫原性

目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)具有多向分化潜能,又因其低免疫原性,成为细胞移植治疗的良好选择。本实验室前期实验表明猪MSC具有低免疫原性和免疫调节作用,而猪MSC在人体内微环境中,将自动分化。本试验研究猪MSC在体外诱导分化后是否还能维持其低免疫原性,仍具有免疫调节作用。方法:MSC细胞从近交系版纳微型猪骨髓中分离获得,转入SV40基因,进行永生化。再用β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸磷酸盐等体外诱导其分化为成骨细胞,以未分化MSC为对照,用RT-PCR法检测分化MSC的主要组织相容性抗原(swine lymphocyte antigen classⅠ、classⅡ,SLAⅠ、SLAⅡ)的表达情况,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测分化MSC是否仍不能引起人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)的增殖反应。结果:RT-PCR结果显示未分化MSC只有SLAⅠ表达;分化MSC既有SLAⅠ,也有SLAⅡ的表达,但很低。这一结果支持MSC的低免疫原性特性。混培结果也显示分化猪MSC与未分化猪MSC一样都不引...     

面神经再生微环境的蛋白质分布及针刺对其的影响

目的　探讨面神经再生微环境的蛋白质分布及穴位针刺对该微环境的影响。方法　建立兔面神经再生微环境动物模型 ,采用蛋白质双向凝胶电泳技术对面神经再生微环境中的蛋白质进行了检测和分析。结果　神经再生液中的蛋白质主要分布于相对分子质量 80× 10 3以下 ,等电点 4～ 7之间 ,对照组检测到 80 0± 5 3个蛋白质点 ,针刺组检测到 85 0± 78个蛋白质点 ,在匹配的点中 ,有十几种蛋白质发生了明显变化。结论　尚不能证实针刺对面神经再生微环境有积极的影响作用     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养的生物学特性及其永生株的初步建立

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞（HUASMC）原代．传代培养的最佳方法，并初步建立其永生株。方法 采用人脐动脉血管中膜组织块贴壁法原代培养，比较不同培养养基对原代及传代细胞增殖的影响；选择标记为新霉素（G418）的带有端粒酶催化亚基（hTERT)基因的重组质粒导入人脐动脉血管平滑肌细胞。结果 经α肌动蛋白鉴定，组织块贴壁洒可获得高纯度的HUASMC。原代培养的HUASMC1－4代细胞增殖能力强，生长旺盛，此后细胞的增殖逐渐降低，到第10代几乎丧失增殖力。原代培养以MCDB131为最佳培养基。hTERT转染细胞克隆由长梭形变为短梭形，接触抑制消失，生长速度快，目前已传至20代，增殖能力与第1代无差别。转染前后平滑肌特异的α－肌动蛋白表达阳性。结论 hTERT转染的HUASMC保留了HUASMC的基本生物学特征，能保持较强的增殖能力持续传代。     

大肠菌素Colicin S4的重组表达、分离纯化和性质

传统抗生素的广谱抗菌特性是诱导细菌普遍产生耐药性重要原因之一。细菌素由于具有窄谱抗菌活性而可能被开发为新一代抗菌药物。大肠菌素因被认为对人体安全而倍受关注。本研究利用PCR方法获得了大肠菌素S4及其抑制蛋白基因并将其克隆到pQE30质粒中,构建了表达质粒pQE30-Col S4。大肠菌素S4在该表达体系中以可溶形式高表达,产量达到30~50 mg/L。活性分析发现,带有6His标签的重组大肠菌素S4与天然大肠菌素S4特性一致,仍具有对大肠杆菌的选择性抗菌活性,是一种有潜力的抗菌物质。     

大肠杆菌表达的人源性抗CTLA4单链抗体三种复性方法比较

比较表达于大肠杆菌中的人源性抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4单链抗体(A n ti-CTLA 4 scFv)的三种体外复性方法的复性效率。稀释、透析和亲和柱上三种复性方式复性A n ti-CTLA 4 scFv,采用B rad ford法分析蛋白复性得率,采用间接细胞EL ISA法检测所得蛋白的活性。透析复性蛋白得率最高,稀释复性蛋白得率其次,亲和柱上复性蛋白得率最低;透析复性所得蛋白结合活性是稀释复性的1.95倍,是亲和柱上复性所得蛋白活性的4.13倍(无谷胱甘肽氧化还原对G SH/G SSH)及3.63倍(有G SH/G SSH)。结论:采用含0.15 m o l/L N aC、l1 mm o l/L G SSH和3 mm o l/L G SH的50 mm o l/L T ris-HC l(pH 8.0)缓冲液作为A n ti-CTLA 4 scFv的复性液,4℃下透析复性48 h,可获得较高复性得率和结合活性。     

酶组织化学方法在HA/TCP体内外生物相容性评价中的初步应用

通过研究材料与细胞 /组织相互作用后胞内酶活性的变化与材料生物相容性之间的关系 ,探讨酶组织化学法应用于材料生物相容性评价的可行性。结果发现 ,与 HA/ TCP和钛合金复合培养的成骨细胞形态学上无明显差异。但 HA/ TCP与兔成骨细胞复合培养初期可导致细胞 NADH、SDH、L DH和 CCO酶活性的一过性下降 ,而钛合金对复合培养细胞的酶活性没有明显影响 ,提示 HA/ TCP材料溶出物对细胞有轻微的损伤。两种材料体内植入后引起的组织学变化过程相似 ,主要表现为损伤引起的急性炎症过程。酶组织化学检测发现 ,术后 10 d内植入体周围组织四种酶活性均明显下降 ,15 - 30 d内逐渐恢复正常。但 HA/ TCP组酶活性的恢复略滞后于钛合金组 ,也表明材料溶出物对细胞有一定损伤。体内外实验均发现酶学指标能更灵敏地反映材料对细胞的作用 ,酶组织化学法可望应用于材料生物相容性评价。     

生物材料有效性和安全性评价的现状与趋势

对生物材料进行有效性和安全性评价是生物材料进入临床前的关键环节。从细胞和组织的水平,利用形态学的检测方法观察材料与机体短期和长期的互作关系是以往评价生物材料的主要内容和手段。新型生物材料近年来迅猛发展,材料的组成、形态、植入部位及用途日趋复杂,对材料的评价相应提出了更高的要求。发展快速、特异、评价体系至关重要。体外实验因操作可控性强,影响因素单一,重复性好而得到大力的发展,通过体内-体外实验的相关分析有望部分替体内实验。近交大动物的开发为生物材料的体内评价更接近人体的真实反应提供了新的契机。近几年来,大量分子生物学的先进检测手段的应用生物材料的评价向细胞和分子水平迈进。TR-PCR、核酸/蛋白杂交技术可以从分子的层面寻找材料和机体互作的重要的分子标记,而显微探测技术（如CONFUCAL）等的应用通过对图像的三维重建而达到对材料-细胞、材料-组织、细胞-组织相互作用清晰而透彻的观察。总之。三“R”原则（replace refine reduce)即发展体外实验;采用灵敏、特异、先进的检测手段;优化并减少实验动物数量,建立材料对分子、细胞、机体互作的系统性评价是生物材料评价的发展趋势和最终目的。     

用双向电泳技术探讨益生注射液抗缺血再灌注损伤的分子机制

目的：用双向电泳技术探讨天然成分组方药物益生注射液抗移植物缺血再灌注损伤的分子机制。方法：利用血管内皮细胞缺氧损伤模型模拟移植器官的缺血再灌注损伤过程，通过双向电泳技术观察受损细胞用药修复前后蛋白质组的变化，探索药物作用的靶标及分子机制。结果：发现缺血再灌注损伤可以导致内皮细胞大量蛋白质含量发生变化，但只有8种蛋白质在用药前后含量发生明显改变(其中6种蛋白质在细胞受损后含量下降，益生药物干预后上调；另2种受损后含量增高，药物作用后下调)。结论：双向电泳技术为分析药物作用的分子机制提供了新的有效手段，益生注射液可能将血管内皮细胞的8种蛋白质作为靶标，通过调节其含量而发挥抗缺血再灌注(缺氧再给氧)损伤作用。     

恒河猴凝血因子Ⅶ的体外表达初探

[目的]探索恒河猴凝血因子Ⅶ的体外原核蛋白表达方法.[方法]利用已得到的恒河猴凝血因子Ⅶ cDNA序列,构建了带有6His表达标签的大肠杆菌原核表达重组质粒pET-DsbA-MCFⅦ,再转入大肠杆菌中进行诱导表达,并使用SDS-PAGE蛋白质电泳和Western Blot法检测蛋白表达情况.[结果]目的蛋白主要以包涵体形式表达,但是在菌液上清和菌体裂解液中也能检测到可溶形式的目的蛋白.[结论]恒河猴凝血因子Ⅶ在大肠杆菌中能够以可溶形式表达.