-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶基因-495~+25区调节活性

α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)的生理功能尚不清楚,近年研究表明,α-SYN与帕金森病(Parkinson's disease,PD)的发生发展密切相关[1].最近的研究显示,在α-SYN过表达的细胞系,酪氨酸羟化酶(ty6rosine hydroxylase,TH)的表达显著减少[2],提示α-SYN的功能与多巴胺代谢密切相关.     

外周神经损伤大鼠背根神经节中Ephrin B1及RYK 受体表达的变化

目的研究外周神经损伤后背根神经节细胞中Ephrin B1及其相关受体的表达变化。方法建立一侧坐骨神经夹伤的大鼠动物模型,通过免疫荧光组织化学方法检测受损侧背根神经节细胞中Ephrin B1及其相关受体Eph B1、Eph B2、Eph B3和Eph A4、RYK等的表达,并分析阳性细胞数和不同大小阳性细胞的构成比例。结果外周坐骨神经受损侧背根神经节细胞中Ephrin B1的表达明显减弱,而Eph B1、Eph B2、Eph B3和Eph A4受体的表达无明显变化,但RYK受体的表达则明显加强。结论Ephrin B1和RYK受体在一侧外周坐骨神经夹伤后的大鼠背根神经节细胞中表达的变化,说明它很有可能参与了损伤后的功能活动。     

一种低成本、低本底的免疫细胞化学反应方法

为了探讨一种适合培养细胞的低本底、低成本免疫细胞化学方法 ,本研究将低浓度的 Triton X-10 0加入抗体稀释液和洗液中 ,观察了其对 ABC反应时的抗体和 ABC的使用浓度和反应效果的影响。结果证明 ,在抗体稀释液和洗液中加入 0 .1%Triton X-10 0可以增强细胞对抗体的通透性 ,在不减弱阳性信号的状况下使 -抗的使用浓度明显降低 ,使生物素化二抗和 ABC的使用浓度达到 1/ 10 0 0～ 1/ 40 0 0 ,并大大减弱染色本底。本研究结果提示 ,在这一稀释度明显低于目前试剂盒建议的使用浓度。在充分显示阳性信号的前提下 ,使抗体的使用浓度和量大幅度减少 ,从而实现了降低本底和实验成本的目的     

α-突触核蛋白在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的研究α-突触核蛋白（α-synuclein）在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位,为阐明其正常的生理功能提供线索.方法超小金标记结合银增强免疫电镜技术.结果α-突触核蛋白不仅存在于神经细胞的突触前终末,也见于神经细胞的轴突、胞浆与核中.在突触前终末,α-突触核蛋白的分布与突触小泡无明显的关系.在神经细胞核内,靠近核膜部分α-突触核蛋白的分布较为密集,细胞核中心部位α-突触核蛋白则较为稀疏.在胞浆和轴突中,α-突触核蛋白散在分布.另外,在线粒体中也有该蛋白表达.结论α-突触核蛋白广泛分布于神经元的各个部位,可能参与神经元的多种生理功能.     

α-突触核蛋白过表达对黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶表达的影响

目的 研究α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法 在α—SYN基因转染的MES 23．5大鼠黑质多巴胺能神经元细胞系，分别用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法分析α-SYN和TH的表达以及两者之间的关系。通过绘制生长曲线和MTT测试细胞氧化还原活性，观察α—SYN基因转染细胞的生长和损伤情况。结果 α-SYN过表达明显抑制MES 23．5多巴胺能神经元的TH表达，但对该细胞的生长和增殖无明显影响，也不引起该细胞损伤。结论 α-SYN过表达对多巴胺能神经元的TH表达具有抑制作用。     

帕金森病和多系统萎缩患者红细胞中α-突触核蛋白寡聚体含量及其与临床症状的相关性

目的分析帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)患者红细胞中的α-突触核蛋白寡聚体(RBC-O-α-Syn)含量及其与临床症状的相关性。方法收集2020年7月至2021年10月从首都医科大学宣武医院功能神经外科、神经内科招募的PD患者296例, MSA患者85例, 同期从北京老年纵向研究社区队列招募健康对照(HC)受试者403名。ELISA测试RBC-O-α-Syn含量。单变量线性回归模型分析各种运动和非运动评分, 如帕金森病统一评定量表(UPDRS)Ⅲ、多系统萎缩统一评定量表(UMSARS)Ⅲ、简易智力状态检查量表(MMSE)、快速眼动睡眠行为障碍-香港(RBDQ-HK)及蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分与RBC-O-α-Syn含量的相关性。受试者工作特征(ROC)曲线评估RBC-O-α-Syn区分PD、MSA患者和HC受试者的特异度、灵敏度和曲线下面积(AUC)。结果 HC组受试者年龄(70±8)岁;PD患者年龄(64±9)岁, 其中, 震颤为主型PD(TD-PD)115例(38.9%), 姿势不稳步态障碍为主型PD(PIGD-PD)132例(44.6%), H-Y分期为2期的患...     

细胞外α-突触核蛋白对MES23.5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的研究细胞外α-突触核蛋白(-αsynuclein,-αSyn)对MES23.5多巴胺能神经细胞增殖的影响。方法细胞外施加重组人-αsyn,Western blot分析和免疫细胞化学染色观察-αSyn向细胞内的进入和分布,MTT测试神经细胞的增殖。结果Western blot和免疫细胞化学染色结果均显示,细胞外-αSyn可以进入MES23.5多巴胺神经细胞并促进其增殖,这种促进作用随剂量增加而增强。-αSyn单抗明显抑制-αSyn向细胞内转移,并阻断-αSyn促细胞增殖作用。结论细胞外-αSyn对多巴胺能神经细胞的增殖具有促进作用。     

缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白水平及磷酸化形成比例的改变

目的分析缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白(α-Syn)水平以及α-Syn磷酸化形成比例的改变。方法回顾性分析2013年5—9月武警后勤学院附属医院神经内科急性缺血性卒中住院患者45的临床资料,另收集同期年龄和性别相匹配的45名健康者为对照组。利用双抗体夹心的酶联免疫吸附(ELISA)法测定血浆中的磷酸化α-Syn水平。另将基因重组α-Syn加入血浆,计算磷酸化α-Syn占总α-Syn的比例。结果缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平明显高于对照组[(0.0472±0.0042)μmol/L比(0.0312±0.0043)μmol/L];缺血性卒中患者血浆α-Syn磷酸化形成比例高于对照组[(0.1170±0.0176)μmol/(100μmol·h)比(0.0364±0.0098)μmol/(100μmol·h)]。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,血浆磷酸化α-Syn水平变化判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.88和0.81,曲线下面积(AUC)为0.91,cut-off值为0.060 mol/L,AUC 95%CI:0.889~0.961;血浆α-Syn磷酸化形成比例改变判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.84和0.81,AUC为0.90,cut-off值为0.055mol/L,AUC 95%CI:0.898~0.971。结论缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平和血浆α-Syn磷酸化形成比例较健康者增高。     

α-突触核蛋白存在于大鼠脑线粒体中

目的研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)是否存在于正常大鼠脑线粒体中以及是否能够转运至线粒体内。方法用免疫印迹和免疫电镜方法检测大鼠脑线粒体中是否存在α-SYN。将人重组α-SYN与分离的线粒体孵育,用免疫印迹法检测α-SYN是否可以转运到线粒体中。结果免疫印迹和免疫电镜方法均证实α-SYN广泛存在于正常大鼠脑的线粒体中,不同脑区的α-SYN含量不同,其中纹状体、嗅球、海马和丘脑的线粒体中α-SYN的含量高于大脑皮质、脑干和小脑。人重组α-SYN与不含内源性α-SYN的分离大鼠小脑线粒体进行孵育,表明α-SYN以剂量依赖的方式转移至线粒体内。结论在正常情况下α-SYN存在于线粒体内,线粒体的α-SYN有可能源于胞质α-SYN向线粒体的转运。     

重组大鼠α突触核蛋白的制备与鉴定

目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。