HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的克隆并体外表达HPV58E6,为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础.方法通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白,化学发光法检测,X光胶片曝光显影鉴定.结果酶切电泳证实质粒构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带,X光胶片亦在相应位置出现印迹条带.结论成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,为其致癌作用和治疗的研究奠定基础.     

巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后RAGEmRNA的时序性表达及其意义

目的：研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响，探讨HCMV感染致动脉粥样硬化的作用机制。方法：用HCMV感染HUVEC，采用RT PCR方法检测不同感染时段细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染HUVEC后，0?h时RAGEmRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时表达水平明显升高，随感染时间延长，表达量逐渐增高，感染24?h时达高峰，48?h开始回落，72?h表达量仍维持在较高的水平，显著高于0?h。各时段与0?h比较，均有统计学意义(P＜0.01)。结论：HCMV感染人脐静脉内皮细胞后能够促进RAGE mRNA的表达，并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过上调RAGE介导内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

加强实验教学改革，提高医学微生物学教学质量

为提高医学微生物学实验教学质量,激发学生学习兴趣、培养科学思维、掌握实验操作技能,进行了一些改革和探索。文章从整合实验教学内容,开发综合性试验;引入设计性实验教学法,发挥学生主观能动性;加强实验室建设,重视生物安全方面以及改进实验教学手段,增添实验内容等方面进行了阐述。     

软甲症2例

临床资料例1女，16岁，学生。因指甲变白变软4周来诊。患者于4周前发现左手拇指和右手中指指甲根部变白，触之较软，面积渐增大，发病以来患处无自觉症状。患者平素喜欢吃零食，自述手部经常出现潮湿多汗症状。无慢性病史，无放射性物质接触史。     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

HPV16L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640 10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。     

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的：获得纯的重组SARSCoV M蛋白，并初步测定重组蛋白的抗原性。方法：软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断，体外合成编码SARSCoV M蛋白15．170aa序列的DNA片段，利用DNA重组技术，将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒pGEX．SARSCoV M。在大肠杆菌BL2l中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白，分离纯化GST-SARSCoV M蛋白，利用纯化蛋白作为抗原，建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体。结果：GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD，纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体，53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体。结论：SARSCoV M蛋白表达成功，在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体。     

用原位杂交技术检测人子宫颈癌组织中HPV16E_6转化基因的研究

应用地高辛非放射性标记与检测系统制备人乳头瘤病毒１６型Ｅ６（ＨＰＶ１６Ｅ６）转化基因ＤＮＡ探针，经用斑点杂交检测，探针特异性强，灵敏度达０．１ｐｇ，应用组织切片原位杂交技术检测了４４例子宫颈癌组织。结果表明，ＨＰＶ１６Ｅ６阳性２７例、占６１．３６％，５例正常对照子宫颈组织中未检出。提示ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因与子宫颈癌密切相关，为阐明子宫颈癌的病因和ＨＰＶ１６Ｅ６在诊治子宫颈癌中的作用提供了理论依据。     

优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应

目的：探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型（HPV 6b）基因表达及免疫原性的影响，为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础。方法：设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(humE7）全长基因。测序验证无误后，定向克隆于pcDNA3的Kpn I和EcoR I位点，成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7。体外转染COS－1细胞，免疫荧光检测其E7蛋白表达。C57BL／6小鼠胫前肌内接种裸DNA，观察其诱导的细胞免疫反应。结果：pcDNA3-hu-mE7在COS－1细胞获得明显表达，表达产物主要位于细胞核中。DNA免疫结果显示，与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较，pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高，CD8^ 和CD4^ 淋巴细胞活性增强。结论：优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应。