EBV-LMP1与HSP90 β真核双表达质粒的构建及体外表达

目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）与热休克蛋白90β（HSP90β）基因，构建其真核双表达质粒pIRES—LMP1-HSP90β，并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA，逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段，将二者连接于真核双表达质粒pIRES中，测定序列后，用脂质体包裹转染COS细胞，采用RT—PCR和Western blot检测LMP1和HSP90β的表达。结果核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确，该双表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1和HSP90β分子。结论实验所构建的pIRES-LMP1-HSP90β双表达质粒能在体外同时表达LMP1和HSP90β分子。     

MIG(CXCL9)表达载体构建及体外活性鉴定

目的构建MIG（CXCL9）真核表达载体，为利用MIG研究肿瘤基因治疗奠定基础。方法从pBLAST-MIG上切下含MIG全长的cDNA序列，定向插入pORF-mcs真核表达质粒，构建pORF-MIG重组质粒；然后经酶切分析和测序鉴定后，通过脂质体介导转染COS-7细胞；再进一步用免疫印迹法鉴定重组质粒的表达活性，用趋化试验鉴定生物学活性。结果pORF-MIG重组质粒经酶切分析和测序证实含有MIG的全长cDNA序列，转染COS-7细胞后高效表达MIG蛋白，对活化的淋巴细胞有趋化作用。结论成功构建了MIG（CXCL9）真核表达质粒，为进一步利用pORF-MIG研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。     

EBV-LMP1与HSP90真核双表达质粒的构建及体外表达

目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)与热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核双表达质粒pIRES-LMP1-HSP90β,并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA,逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段,将二者连接于真核双表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1和HSP90β的表达。结果核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该双表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1和HSP90β分子。结论实验所构建的pIRES-LMP1-HSP90β双表达质粒能在体外同时表达LMP1和HSP90β分子。     

Adiponectin与肿瘤

adiponectin作为脂肪细胞分泌的一种多肽激素,在肿瘤发生中起着重要的抑制作用,它主要是通过与血管发生的相关活性负调控肿瘤的发生发展,并通过结合某些肿瘤细胞中的adiponectin受体或者激活其下游信号通路而直接作用于肿瘤细胞。鉴于adiponectin抑制血管生成的特性以及启动caspase家族诱导细胞凋亡的作用,有望成为一种新的肿瘤治疗药物。     

Adiponectin真核表达质粒的构建与表达研究

目的构建重组鼠adiponectin真核表达质粒,为进一步研究adiponectin的功能提供实验基础。方法提取鼠脂肪组织总RNA,运用RT-PCR方法扩增鼠adiponectincDNA完全编码区,将扩增产物连接至pCDNA3.1( )载体,对重组质粒进行测序验证,并检测其体外表达和对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖抑制作用。结果重组真核表达质粒经PCR扩增后获得一744bp片段,并经测序证实,Western-blot检测到其体外表达。在体外的细胞学实验中,将重组质粒转染入小鼠乳腺癌细胞4T148h后,与对照组相比,可以观察到明显的细胞形态学改变,细胞体积变小皱缩,4T1细胞生长明显抑制。流式细胞术检测到该组细胞中凋亡细胞所占比例明显高于对照组。结论成功构建了鼠重组adiponectin真核表达质粒,该质粒对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖有明显的抑制作用。     

HNP1基因转染对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长影响的实验研究

目的:观察人α-防御紊HNP1基因对人鼻咽癌细胞株HNE-1生长的影响,探讨其在裸鼠鼻咽癌移植瘤生长中的作用.方法:HNP1基因通过脂质体介导转染人鼻咽癌HNE1细胞株,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察对HNE-1细胞的细胞毒性作用,将筛选的含pcDNA3.1( )-HNP1质粒的HNE-1细胞和空pcDNA3.1( )质粒的HNE-1细胞以及单纯的HNE-1细胞培养、收集后分别注射于8周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧腹壁皮下,观察肿瘤生长速度,免疫组织化学检测α-防御素1在肿瘤组织中的表达.结果:HNP1基因转入鼻咽癌HNE-1细胞后能成功地表达有活性的α-防御素1,MTT实验证实有细胞毒作用,转染HNP1基因组裸鼠较对照组肿瘤生长速度慢,体积小.结论:通过转基因方法能表达有活性的α-防御素1并能抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长.     

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响.方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断.构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照.RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确.转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断.与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48 h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05).流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05).结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

重组腺病毒mCD40L联合5-Fu治疗小鼠腹腔肿瘤的研究

目的 探讨重组腺病毒鼠CD40配体基因(Ad-mCD40L)对小鼠CT26腹腔肿瘤的治疗作用.方法 建立小鼠CT26腹腔肿瘤动物模型,检测腺病毒介导的鼠CD40配体基因联合5-Fu对肿瘤生长的抑制作用.结果 腹腔内灌注Ad-mCD40L+5-Fu,可明显抑制CT26肿瘤结节的生长.Ad-mCD40L能激发小鼠特异的免疫反应,增强诱导肿瘤细胞凋亡的作用,抑制肿瘤细胞的增殖.结论 Ad-mCD40L联合5-Fu可产生更强的抗肿瘤效应,为结肠癌的生物-化疗提供了新的思路.     

脂质体-IP10复合物对小鼠4T1乳腺癌的治疗作用

目的 用1,2-二油酰-3-三甲胺基丙烷(DOTAP)+胆固醇(CHOL)脂质体包裹pcDNA3.1-γ干扰素诱导蛋白-10(IP10)制备脂质体质粒DNA复合体即Lip-IP10,观察其对抗小鼠4T1乳腺癌的原位瘤及肺转移瘤的治疗作用,并探讨其作用机制.方法 建立4T1乳腺癌模型,将36只荷瘤小鼠随机分为生理盐水(NS)组、脂质体-pcDNA3.1复合物(Lip-null)组和脂质体-IP10复合物(Lip-IP10)组,尾静脉给药,观察各组肿瘤体积、肺转移结节数及小鼠生存期.原位瘤进行CD31染色,测定微血管密度(MVD).结果 与两对照组比较,Lip-IP10组的肿瘤体积明显较小(P<0.05),肺转移结节显著减少(各组中位数为NS组45个,Lip-null组40个,Lip-IP10组 3个,P<0.05),生存期延长(P<0.05),CD31染色结果 显示,Lip-IP10组的肿瘤MVD值较低(NS组44.25±5.51,Lip-null组 43.45±4.21,Lip-IP10组21.50±5.41,P<0.05). 结论 静脉给予Lip-IP10复合体可抑制小鼠4T1乳腺癌的原位瘤及肺转移瘤,其作用机制与IP10抑制肿瘤血管生成有关.     

趋化因子BLC表达载体构建及在肿瘤细胞中的表达

目的 建立真核表达重组体pcDNA-BLC的稳定转染细胞株,为研究趋化因子BLC的抗肿瘤免疫作用机制奠定基础。方法 以小鼠脾脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增BLC全长cDNA,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3．1( )真核表达质粒,构建重组质粒pcDNA-BLC,重组子经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术导入Colon26细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株。用免疫印迹法(Western Blot)鉴定转染细胞表达的蛋白质,证实BLC存在。用趋化实验证实转染细胞株表达的BLC有生物学活性。结果 真核表达重组体pcDNA-BLC构建成功,pcDNA-BLC稳定转染细胞株表达有生物学活性的BLC。结论 成功建立了BLC的稳定转染细胞株,为研究BLC的抗肿瘤免疫作用机制继而发展肿瘤疫苗奠定了基础。