人肝癌及癌旁组织中Smad 4、Smad 7 mRNA和蛋白表达研究

目的 :分析Smad 4、Smad 7mRNA和蛋白在人肝癌组织中的表达并与癌旁组织比较 ,了解Smad 4mRNA和蛋白与肝癌临床病理特征之间的关系。方法 :用原位杂交和免疫组化方法检测 36例肝癌存档病理标本和其中的 2 8例癌旁组织病理标本Smad 4、Smad 7mRNA和相应的蛋白。结果 :Smad 4mRNA和其蛋白在肝癌组织中的表达低于肝癌癌旁组织 ,癌组织表达率分别为 2 8%和 19% ,癌旁组织表达率分别为 86 %和 75 % ,两者之间差别有统计学意义(P <0 .0 1)。Smad 7mRNA和其蛋白表达则相反 ,癌组织表达强 ,表达率分别为 6 6 %和 6 4 % ,癌旁组织表达率分别为14 %和 36 % ,两者之间差别有统计学意义 (P <0 .0 1和P <0 .0 5 )。Smad 4mRNA和蛋白与肝癌患者年龄、性别和肿瘤大小无关 ,但与肿瘤细胞类型、是否转移存在相关性。结论 :Smad 4和Smad 7蛋白作为转化生长因子 - β(TGF β)信号转导途径的下游分子 ,在肝癌组织中表达发生了改变 ,参与肝癌的发生、发展。     

Smad2小干扰RNA载体的构建及其沉默效应的鉴定

目的构建smad2特异性小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测肿瘤细胞中其对smad2基因表达的干扰效果。方法根据smad2基因序列设计合理的smad2 siRNA,并将合成的寡核苷酸序列克隆到pSliencer 2.1-U6 neo载体中,转化大肠杆菌DH5α;挑取阳性菌落进行质粒酶切和序列分析;将构建正确的smad2 siRNA重组质粒转染,或与带Flag标签的smads真核表达载体共同转染293T细胞或HeLa细胞,收集细胞裂解物,Westem印迹检测siRNA的干扰效果。结果正确构建了smad2 siRNA重组质粒,对smad2表达的特异性干扰效果可达70%以上。结论成功构建了smad2 siRNA载体,为进一步探讨smad2在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

Amifostine does not prevent activation of TGFbeta1 but induces smad 7 activation in megakaryocytes irradiated in vivo

Experiments were undertaken to assess the role of amifostine in the activation of latent TGFbeta1 and in the smad proteins cascade (smad 2/3, smad4, smad7), focusing on megakaryocytes, in the bone marrow irradiated in vivo. Non-irradiated megakaryocytes were negative for active TGFbeta1. Immunopositivity to active TGFbeta1 was detected in megakaryocytes 10 days after irradiation in amifostine- treated and untreated marrows. Smad 2/3 and smad 4 were strongly positive in the nucleus of megakaryocytes 10 days after irradiation. At the same time, a predominant hypocellular bone marrow with foci of hematopoiesis was observed with few megakaryocytes. An increase in the number of reticulin fibers was also seen. In amifostine-treated marrows, smad 2/3 and smad4 were not detected in the nucleus but were positive in the cytoplasm of megakaryocytes 10 days after irradiation. Coincidentally, bone marrows were cellular with megakaryocytes. Smad7 immunoexpression was detected in the cytoplasm of megakaryocytes in the non-irradiated, amifostine-treated and in the irradiated, amifostine-treated marrows. Data indicate that amifostine does not prevent latent TGFbeta1 activation in irradiated megakaryocytes. While TGFbeta1 signal transduction occurs in megakaryocytes in untreated bone marrows, it is inhibited in megakaryocytes in amifostine-treated marrows due to the induction of smad 7 activation. This is the first report showing smad 7 activation by amifostine. Our results also suggest a role for TGFbeta1 as an inhibitor of megakaryocytes in vivo.     

肝卵圆细胞对大鼠肝硬化组织TGFβ/smad信号传导的影响

【摘要】〓目的〓探讨肝卵圆细胞对TGFβ/smad信号传导通路影响的机制,并证明肝卵圆细胞对肝硬化的发展是否有阻止和逆转的作用。方法〓对肝卵圆细胞进行增殖、分离、培养后,移植于肝硬化大鼠肝脏组织,以未经移植的大鼠做对照,分别进行组织病理学和肝功能及蛋白表达水平的检测,分析ALB、AST、ALT、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad4 、Smad7的情况。结果〓移植肝卵圆细胞的鼠肝硬化组织纤维化减少,肝功能明显改善(P<0.05),肝硬化组织TGFβ/smad信号通路中各蛋白表达量有差异。结论〓肝卵圆细胞刺激肝硬化细胞后TGFβ/smad信号通路中各蛋白的表达是不同的,肝卵圆细胞对肝硬化组织有阻止和逆转的作用。     

smad4 shRNA 真核表达质粒的构建及鉴定

 目的 针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果 3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实：3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论 成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

Transforming Growth Factor-beta signal responding in hepatic stem-like cells

Objective To investigate the effects of TGF-β on the expressions and distribution of phosphorated Smad2/3 and Smad7 in hepatic stem-like cells.Methods Using immunogold transmission electron microscopy,we observed the expressions and distribution of phosphorated Smad2/3,and Smad7 before and after TGF-β1(5 ng·mL-1)treatment for 4,8,and 24 hours in hepatic stem-like cells(WB cells).In addition,we also detected the apoptosis status after TGF-β1 stimulation by transmission electron microscopy.Results TGF-β1 stimulation can result in expression increasing of phosphorated Smad2/3 in WB cells,and reach the peak at 8 h,especially in the nuclear.After treatment with TGF-β1 for 24 h,the nuclear expression of phosphorated Smad2/3 gradually decreased.Additionally,we found that TGF-β1 treatment also contributed to increasing in protein level and alteration in cellular distribution of Smad7(translocation from the nucleus to the cytoplasm)in WB cells.Furthermore,we observed apoptotic body in WB cells after TGF-β1 treatment for 8 h.Conclusions These results indicate that TGF-β stimulation can alter the expression and cellular distribution of phosphorated Smad2/3 and Smad7 which are its downstream molecular,suggesting hepatic stem-like cells own intact responding to TGF-β.     

化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成的干预作用及对Smad7表达的影响

目的 研究化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成的干预作用及可能作用机制.方法 将大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、激素组,用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉后,经气管内插管注入博莱霉素(5 mg/kg)建立肺纤维化模型,对照组注入生理盐水0.25 ml,从造模后的第2天起分别给予化瘀理肺方药物灌胃(中药组,13 410 mg/kg)、生理盐水灌胃(对照组、模型组)、氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射(激素组,25 mg/kg)进行干预,后于给药后的第14、28天分别处死,取肺组织行苏木素-伊红(HE)染色观察病理变化情况,免疫组化法测定肺组织中Smad7蛋白的表达情况.结果 中药组肺泡炎和纤维化程度明显低于模型组和激素组,中药组Smad7蛋白表达明显高于模型组和激素组(P＜0.01).结论 化瘀理肺方对博莱霉素所致肺纤维化大鼠有一定预防性治疗作用,可能通过促进Smad7蛋白表达发挥作用.     

复黄生肌愈创油膏对糖尿病大鼠创面肉芽组织中TGF—β1与smad3、smad7 mRNA

目的：探讨复黄生肌愈创油膏（简称复黄膏）对糖尿病创面愈合的促进作用及可能的作用机制。方法：将雄性Wistar大鼠随机分为正常创面对照组、糖尿病模型组、复黄膏治疗组。制备糖尿病合并皮肤创面模型,模型组给予生理盐水纱布外敷,治疗组给予复黄膏外敷,1次／d。造模后分别于第3天和第11天分批处死动物,采用实时荧光定量PCR技术,观察不同时段创面中TGF-β1与smad3、smad7 mRNA含量变化。结果：在创面修复的第3天,治疗组TGF—β1、smad3 mRNA表达均明显高于模型组（P〈0．05）,且与正常组比较无统计学差异;第11天,治疗组TGF-β1、smad3 mRNA表达均明显低于正常组（P〈0．05）,但与模型组比较无统计学差异。第3天时,smad7含量各组比较无统计学差异;而第11天时,治疗组明显高于模型组（P〈0．05）,虽然与正常组比较无统计学差异,但药物干预组smad7 mRNA含量高于正常组。结论：复黄生肌愈创油膏在糖尿病溃疡创面愈合过程中可能动态调节smad3、smad7及TGF—β1 mRNA的表达,从而起到促进创面愈合的作用,同时可一定程度上减少瘢痕形成。     

Smad3介导补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响

目的：探讨smad3是否介导了补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响,从而阐明补肾中药具有促进骨形成的机制。方法：分离6月龄和16月龄SD大鼠成骨细胞,采用组织块翻转方法培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并以矿化结节染色对成骨细胞加以鉴定。将SD大鼠随机分为正常组、生理盐水组、单味补阳组（固本壮骨粉）、复方补阳组（金匮肾气丸）、复方平补组（补肾益精方）、复方补阴组（知柏地黄丸）和西药对照组（阿法骨化醇片）,制备药物血清;当成骨细胞汇合达60％,换无血清培养液培养细胞24h后,加入含药血清（浓度为10％）再继续培养3d。采用RT-PCR方法检测含药血清干预后成骨细胞smad3和VDR mRNA的表达。结果：在增龄成骨细胞smad3 mRNA表达是下降的,这与增龄所致VDR mRNA表达下降相一致;单味补阳组、复方补阳组和西药对照组上调smad3 mRNA的趋势与它们上调VDR mRNA的趋势相一致。结论：补阳中药可能通过启动Smad3 mRNA表达而上调VDR mRNA表达,从而促进骨形成。     

益气活血方对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF—β／smad信号通路及结缔组织生长因子的影响

目的：观察益气活血方对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β／smad信号通路及结缔组织生长因子（connectivetissue growthfactor,CTGF）的影响。方法：健康雄性Wistar大鼠30只诱导建立单侧输尿管梗阻（unilateralureteralobstruction,UUO）致肾小管间质纤维化模型,模型成功后随机分为模型组,益气活血方大、中、小剂量组和西药组,另取健康雄性Wistar大鼠6只设为假手术组。3周后处死大鼠,称取体质量;取血清检测肌酐（creatinine,Cr）、尿素氮（bloodureanitrogen,BUN）水平;取肾脏组织采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法和免疫印迹法检测各组转化生长因子G（transforminggrowthfactor—B,TGF-β）、smad2、smad7、CTGFmRNA和蛋白表达水平;苏木精一伊红染色和Masson染色检测各组肾间质纤维化指数。结果：模型组大鼠血清Cr和BUN值较假手术组偏高;与模型组比较,大剂量益气活血方可以降低Cr和BUN值,但差异无统计学意义。苏木精-伊红染色和Masson染色显示模型组肾小管上皮细胞萎缩,大部分肾小管管腔扩张,间质纤维组织增生,大量炎性细胞浸润,肾小球数目明显减少,胶原成分显著增加。益气活血方大剂量组、中剂量组和西药福辛普利钠组大鼠肾间质炎性细胞浸润、纤维组织增生、肾小管扩张情况较模型组明显减轻,胶原成分明显减少。与假手术组比较,模型组大鼠肾脏组织中TGF—D、smad2和CTGFmRNA以及蛋白表达水平明显升高（P〈0．05）,smad7的表达水平则明显降低（P〈0．05）。与模型组比较,益气活血方大剂量组和中剂量组大鼠TGF-β、smad2、CTGFmRNA和蛋白表达明显下降（P〈0．01,P〈0．05）,smad7表达明显升高（P〈0．01,P＜0．05）。结论：UUO大鼠肾组织中CTGFmRNA的表达可能通过TGF-β／smad信号通道进行调节;益气活血方可以通过下调TGF—β、smad2和上调smad7的表达来抑制CTGF表达,进而遏制肾纤维化的进展。