非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化

目的 :从转染syk基因的Sf2 1细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白。方法 :将syk基因转染Sf2 1细胞 ,于 2 8℃培养 48h ,收集细胞 ,用超声波破碎仪裂解细胞 ,提取裂解液中总蛋白 ,用Yellow 3凝胶和Toyopearl AF Heptin 650M凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk蛋白存在和性质 ,用SDS PAGE、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果 :从 2 5亿个Sf2 1细胞裂解液中提取了含有Syk的 2 2 5mg蛋白质。经Yellow 3凝胶层析分离 ,得到两个亚种的Syk蛋白 ,相对分子质量 (Mr)均为72× 10 3 。进一步用Toyopearl AF Heptin 650M凝胶层析纯化后 ,得到两个纯的Syk蛋白 ,SDS PAGE、免疫印迹实验结果显示 ,两种Syk的Mr 均为 72× 10 3,与Syk的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示 ,这两种Syk蛋白成分具有不同的pI值。结论 :从 2 5亿个转染syk基因的Sf2 1细胞中纯化出8mgSyk蛋白 ,纯度高于 95%。这两种Syk的Mr 虽然相同 ,但具有不同的pI值 ,是两个亚种。这些Syk可用于研究Syk的作用机制、抗Syk抗体的制备和Syk诊断试剂盒的制备等     

精-甘-天冬-丝氨酸4肽对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的: 探讨精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS) 4肽对纤维连接蛋白(FN)刺激的肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡及caspase-3表达的影响。方法: 应用体外HSCs培养技术, 采用[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入法测定HSCs增殖;膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术、TUNEL、扫描电镜及透射电镜等方法测定HSCs凋亡;采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率;应用流式细胞方法测定caspase-3蛋白表达。结果: ①25 mg·L^-1、50mg·L^-1、100mg·L^-1浓度RGDS 4肽剂量、时间依赖性抑制HSCs增殖, P＜0.01。②RGDS 4肽对HSCs凋亡的诱导作用亦呈剂量和时间依赖关系, P＜0.01。扫描电镜、透射电镜观察, RGDS 4肽组出现典型的凋亡征象。③RGDS 4肽作用于HSCs 2 h, 25 mg·L^-1、50mg·L^-1、100mg·L^-1组粘附抑制率分别是8.82%、29.41%、45.59%, 而RGES 4肽组的粘附抑制率仅为4.41%, P＜0.01。④RGDS 4肽处理组caspase-3表达明显高于FN、RGES 4肽组。结论: RGDS 4肽剂量和时间依赖性抑制HSCs增殖并诱导其凋亡。RGDS 4肽抑制增殖及诱导凋亡效应, 依赖于caspase-3, 也与其抗粘附作用有关。     

抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白(SMR)的单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性。方法:应用计算机通过综合预测对间皮素(MSLN)进行B-细胞表位预测。合成相应肽段并免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,利用免疫细胞化学和Western blot分析对所制备的mAb进行鉴定。结果:综合预测方法分析间皮素的抗原表位可能于153-162、282-292及471-481氨基酸残基或其附近,选择性合成了可能性最高的位于471-481氨基酸残基的可溶性间皮素相关蛋白表位,制备了mAb(2H10),经免疫细胞化学和Western blot分析该抗体具有较高的特异性。结论:成功地制备了鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白的mAb(2H10),该抗体具有较高的特异性,为进一步利用ELISA对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础。     

不同刺激剂诱导肺癌患者引流淋巴结细胞分泌细胞因子的研究

目的:探讨多种刺激剂对肿瘤引流淋巴结(TDLN)细胞分泌细胞因子的影响及其抗肿瘤效应和机制。方法:采用ELISA和Griess法测定不同刺激组(分别为IL2、IL2 自身肺癌细胞抗原、IL2 GMCSF IL4 自身肺癌细胞抗原和IL2 GMCSF IL4 LPS)刺激TDLN后第7、14、21天,分泌IL12p70、IFNγ、TNFα和NO的水平。结果:IL2 GMCSF IL4 自身肺癌细胞抗原和IL2 GMCSF IL4 LPS组刺激的TDLN细胞中,CD83 细胞的比率明显增多,分泌IL12p70、IFNγ及TNFα的水平也明显高于IL2和IL2 自身肺癌细胞抗原刺激组,IL2 GMCSF IL4 LPS组刺激的TDLN细胞分泌NO的水平明显高于其他3组。各种刺激剂刺激TDLN细胞后,分泌IL12p70、IFNγ和NO的水平在第14天时达到高峰。结论:不同刺激剂诱导TDLN细胞中的CD83 细胞数量不同,故具有不同的抗肿瘤活性。     

中药北豆根抗肿瘤活性的体外实验

背景与目的 :探讨中药北豆根(Rhizomamenispermi)提取物的抗肿瘤作用并分离其活性物质。材料与方法 :采用MTT法测定了北豆根提取物对肿瘤细胞增殖反应的影响 ;用三步法初步分离、纯化了北豆根提取物的抗肿瘤有效部位。结果 :北豆根提取物对多种组织来源的肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用 ,量效关系良好 ,并且对原代培养肿瘤组织细胞增殖反应有抑制作用,IC50 多在9μg/ml以下 ,最低可达0.7μg/ml。并找到了其有效部位。结论 :北豆根水提物和北豆根醇提物体外均有很强的抗肿瘤作用 ;醇提物的作用高于水提物 ;PE2是北豆根醇提物抗肿瘤的有效部位 ;PE2不仅对各肿瘤细胞株有广泛的杀伤作用 ,而且对原代培养肿瘤细胞也有杀伤作用 ;北豆根作为抗肿瘤药物有待进一步开发     

转染CD40配体的卵巢癌细胞株OVHM抗卵巢癌肝转移机制的研究

Objective To examine the in vivo anti-metastatic effect of enhanced expression of CD40L cDNA in murinc ovarian cancer OVUM cells (CD4OL-OVHM) injected into the spleen on liver metastasis in mice. Methods OVUM cells were inoculated into the spleen of 6 ～ 8 week-old female B6C3F1 (C57BL/6N × C3H/He) mice. The established liver metastasis was identified by histopathology (HE staining). OVUM cells, DNA-pMKITneo-OVHM cells or CD40L-OVHM cells were inoculated into the spleen of female B6C3F1 mice and the expressions of CD11c in splenic cells were detected by flow cytometry. The specific cytotoxicity of splenic cells was detected by MTT assay, and the serum cytokines of IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL4 and IL-10 of the mice were measured by enzyme linked immunoabsorbent assay. The liver metastases and the survival time of the mice were also recorded. Results The mouse models with liver metastasis by injecting tumor cells into the spleen of mice were established. The expression of CD11c and the specific killing rote in CD40L-OVHM cells group was significantly higher than that in the OVHM cells group and DNA-pMKITneo-OVHM cells group. The expressions of IFN-γ, TNF-α and IL-12 in the CD40L-OVHM cells group were much more increased than OVHM cells group and DNA-pMKITneo-OVHM cells group, but the expressions of IL-4 and IL-10 in the CD40L-OVHM cells group were decreased significantly (P < 0.05). The average weights of livers and spleens of mice in CD40L-OVHM cells group were significantly lower than those of DNA-pMKITneo-OVHM cells group and OVHM cells group. The survival time of mice in CD40L-OVHM cells group was also significantly longer than that in the OVHM cells group and DNA-pMKITneo-OVHM cells group (P < 0.05). Conclusion The data directly demonstrate that the expression of CD40L in ovarian cancer cells (CD40L-OVHM) can enhance the proliferation and differentiation of dendritic cells in the spleen and induce specific cytotoxic effect of T cells in the spleen, and may regulate the immune function of peripheral blood cells and the immune balance between Thl cells and Th2 cells, which maybe the possible mechanism induced by CD40L in mice inhibiting the development of liver metastasis.     

VEGF反义RNA对人食管癌细胞抑制作用的研究

目的: 研究血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对人食管癌细胞的抑制作用,探讨以VEGF反义RNA进行食管癌基因治疗的可行性.方法: 采用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染入食管癌细胞TE-1;用MTT法检测细胞增殖情况;用免疫组化法检测VEGF蛋白表达;原位杂交和RT-PCR技术检测VEGFmRNA的表达.流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布.结果: 被反义VEGFcDNA质粒转染的食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞的VEGFmRNA及蛋白表达水平降低,但细胞生长速率无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠后,形成肿瘤的时间明显延长,肿瘤的体积和重量明显减小.结论: VEGF反义RNA可抑制食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内的肿瘤生长.该表达体系为食管癌基因治疗的进一步研究奠定了基础.     

五加皮Age蛋白在正常小鼠与荷瘤小鼠体内的组织分布

目的探讨五加皮抗肿瘤成分A ge蛋白在正常小鼠与荷瘤小鼠体内的组织分布。方法用氯胺T法对A ge蛋白进行125I标记(形成125I-A ge),由尾iv小鼠后,于不同时间取组织和血液标本,测定放射cpm比值。以放射参与量(即脏器与血液中cpm比值)作为125I-A ge在组织中分布的依据。结果在一次性快速iv125I-A ge 2 h后,正常小鼠和荷瘤小鼠体内均以肾脏中125I-A ge的分布量最高,肝脏和肺部放射参与量也较高,与心脏、脾脏等其他脏器相比差异有显著性(P<0.01);尿中125I-A ge的量很高。iv同等剂量125I-A ge后,荷瘤小鼠的肾脏、肝脏和肺部组织的放射参与量比正常小鼠偏高(P<0.05)。结论五加皮A ge蛋白在小鼠体内主要分布于血流丰富的组织,主要通过泌尿系统排泄,不易透过血脑屏障。     

促红细胞生成素对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:检测促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对荷黑色素瘤小鼠免疫功能的影响.方法:将C57BL/6小鼠随机分为3组:正常对照组、盐水处理组和EPO处理组,盐水处理组和EPO处理组小鼠皮下接种黑色素瘤细胞B16.17天后,检测各组小鼠外周血中红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(Hct)和白细胞(WBC)数量及脾脏脏器指数;应用流式细胞术检测脾细胞CD4+、CD8+T细胞亚群的分布;ELISA检测血清中IL-2和TNF-α细胞因子的水平.结果:盐水处理组荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb和Hct含量明显低于正常对照组小鼠(P＜0.05),应用EPO可明显提高荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb和Hct含量及脾脏脏器指数(P＜0.05),三组小鼠外周血中WBC数量无明显差别(P＞0.05);盐水处理组及EPO处理组荷瘤小鼠脾脏CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+T细胞比值明显低于正常小鼠(P＜0.05).EPO处理组与盐水处理组相比,CD4+T细胞百分率无差别(P＞0.05),而CD8+T细胞百分率下降(P＜0.05),致使EPO处理组小鼠CD4 +/CD8+T细胞比值升高(P＜0.05);盐水处理组及EPO处理组荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2含量明显低于正常小鼠(P＜0.05),EPO处理组小鼠血清中IL-2水平与盐水处理组相比增高(P＜0.05),但该两组小鼠血清中TNF-α含量无明显差别(P＞0.05).结论:EPO在改善荷瘤小鼠贫血状态的同时,还可通过提高外周血CD4 +/CD8+T细胞比值和IL-2含量而增强小鼠的免疫功能.