脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

关节软骨源性微载体生物相容性及异位成软骨特性观察

目的 观察改良后软骨源性微载体的微观结构及主要成分,其对软骨细胞增殖的影响及体内异位成软骨特性.方法 将新鲜猪软骨片粉碎后,梯度筛滤后得到直径大200～400 μm的软骨源性微载体,经1%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞处理后,Hoechst 33258荧光染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察微载体的主要成分;体外复合软骨细胞后,通过MTT观察软骨源性微载体对软骨细胞增殖的影响;将复合有软骨细胞的软骨源性微载体包埋于裸鼠皮下观察其异位成软骨能力.结果 改良后的微载体形态近似椭圆形,直径200～400 μm,微丝覆盖其表面,微丝长度40～90 nm;脱细胞处理后Hoechst 33258荧光染色阴性;甲苯胺蓝和番红花O组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,第1天以后软骨源性微载体组及条件培养基组的OD值均高于完全培养基组（P〈0.05）;复合有软骨细胞的软骨源性微载体具有异位成软骨能力.结论 本实验成功制备的软骨源性微载体,可作为天然微载体高效扩增软骨细胞,可为组织工程提供优质种子细胞;其具有异位成软骨能力,有望成为软骨组织工程的新型支架.     

兔膝骨关节炎进程中软骨下骨血管生成的实验研究

目的 探讨兔膝骨关节炎发展进程中软骨下骨血管生成的时间依从性的变化,研究软骨下骨血管新生在OA发病机制中的作用.方法 30只新西兰大白兔随机分为前交叉韧带切除组（ACLT组）、对照组,每组15只.ACLT组右膝前交叉韧带切除造模,对照组不作任何处理.分别于术后4周、8周、12周取材.取兔膝关节标本进行大体观察,切片行组织学番红O染色及OARSI病理评分,评价软骨退变.行免疫组化VEGF染色,观察软骨下骨中血管生成情况,同时用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行骨软骨交界血管数量密度的计数检测.结果 ACLT组术后4周即可见软骨退变,8周和12周时退变进一步加重,番红O染色基质丢失、软骨变薄及裂隙生成、软骨下骨裸露.对照组无明显软骨退变,不同组关节软骨OARSI评分有统计学差异（F=440.828,P〈0.01）.切片免疫组化血管内皮生长因子（VEGF）染色示ACLT组阳性表达,ACLT组的血管入侵软骨数目明显高于对照组,且OA各时间点之间有统计学差异（F=72.733,P〈0.01）.结论软骨下骨的血管生成是OA的早期病变,OA中骨-软骨复合单元的血管增生与软骨退变相关.血管侵入软骨的数量密度与OA发展呈时间依从性增加变化.     

关节软骨源性微载体生物相容性及异位成软骨特性观察

目的 观察改良后软骨源性微载体的微观结构及主要成分,其对软骨细胞增殖的影响及体内异位成软骨特性.方法 将新鲜猪软骨片粉碎后,梯度筛滤后得到直径大200～400 μm的软骨源性微载体,经1%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞处理后,Hoechst 33258荧光染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察微载体的主要成分;体外复合软骨细胞后,通过MTT观察软骨源性微载体对软骨细胞增殖的影响;将复合有软骨细胞的软骨源性微载体包埋于裸鼠皮下观察其异位成软骨能力.结果 改良后的微载体形态近似椭圆形,直径200～400 μm,微丝覆盖其表面,微丝长度40～90 nm;脱细胞处理后Hoechst 33258荧光染色阴性;甲苯胺蓝和番红花O组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,第1天以后软骨源性微载体组及条件培养基组的OD值均高于完全培养基组（P〈0.05）;复合有软骨细胞的软骨源性微载体具有异位成软骨能力.结论 本实验成功制备的软骨源性微载体,可作为天然微载体高效扩增软骨细胞,可为组织工程提供优质种子细胞;其具有异位成软骨能力,有望成为软骨组织工程的新型支架.     

膝关节原发性骨关节炎软骨-软骨下骨复合单元改变的实验研究

[目的]观察膝关节原发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)胫骨平台软骨和软骨下骨病理改变特点,评价不同OA期别的骨形态计量学,探讨软骨和软骨下骨在OA发病机制中的相互作用。[方法]取人工全膝关节置换术后的膝原发性OA患者(n=40)自愿捐赠的新鲜胫骨平台标本。大体观察后在胫骨平台内、外侧中央负重区取软骨-软骨下骨复合体并切割等分为A、B两组。A组行番红O/固绿染色,参照Mankin评分标准评分并分1⁴期,观察软骨及软骨下骨病理改变。B组用Mirco-CT扫描测量骨形态计量学参数。[结果]根据Mankin评分,Ⅰ期OA可见软骨浅表层纤维化、潮线复制,Ⅱ期OA可见软骨磨损腐蚀、微骨折形成、血管侵入钙化软骨层,Ⅲ期OA可见多发性裂隙深达软骨下骨、软骨内囊肿、血管越过潮线生长、明显增厚的软骨下骨,Ⅳ期OA可见软骨全层缺失、软骨内化骨、软骨下骨暴露。随OA发展的期别增高,骨矿化密度(bone mineral density,BMD)、骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV)、组织矿化密度(tissue mineralized density,TMD)、骨小梁数目(trabecula number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)呈增长趋势,骨小梁间隔(trabecular spacing,Tb.Sp)及结构模型指数(structure model index,SMI)呈下降趋势,且OA各期之间有显著统计学差异(P<0.05)。评价软骨退变的Makin评分与BMD、BVF、Tb.Th呈显著正相关(P<0.001),与SMI呈显著负相关(P<0.001)。[结论]软骨和软骨下骨构成结构和功能上的复合单元,在OA进展中相互影响。异常力学载荷引发骨重塑,微裂隙和血管等连接通道的存在提示软骨和软骨下骨间存在物质传递和分子交流。软骨下骨的特异性改变和软骨退变密切相关。     

肩峰下前外侧入路治疗肱骨近端2或3部分骨折病例对照研究

目的 :探讨应用肩峰下前外侧入路治疗肱骨近端2、3部分骨折的临床疗效。方法 :回顾分析2010年1月至2014年6月收治的42例肱骨近端2、3部分骨折患者临床资料,其中男23例,女19例,年龄40~76岁,平均61.5岁;应用肩峰下前外侧入路的患者22例,其余20例采用传统的胸大肌三角肌入路。比较两组手术操作时间、术中出血量、术后住院天数、骨折愈合时间,使用VAS评分评估术后1周肩关节疼痛程度,使用肩关节Constant评分评估肩关节术后3个月及6个月以上肩关节功能水平。结果:所有患者完成至少14个月的随访。两组比较,手术时间(P=0.003)、术中出血量(P=0.001)、术后住院天数(P=0.013)、术后1周肩关节疼痛VAS评分(P=0.026)、术后3个月Constant评分(P=0.014),肩峰下前外侧入路组与胸大肌三角肌入路组间差异有统计学意义;骨折临床愈合时间(P=0.462)、术后6个月以上Constant评分(P=0.204),肩峰下前外侧入路组与胸大肌三角肌入路组间差异无统计学意义。未出现肱骨头坏死、内固定断裂的情况。结论:应用肩峰下前外侧入路治疗肱骨近端2、3部分骨折,具有手术时间短、创伤小、术后疼痛轻、功能恢复快等优点。     

膝关节骨性关节炎患者胫骨高位截骨术后恢复运动的影响因素

目的探讨膝关节骨性关节炎患者胫骨高位截骨术后恢复运动的影响因素。方法选择2015年5月至2018年5月在北京京煤集团总医院因膝关节骨性关节炎做胫骨高位截骨术治疗的73例患者作为研究对象,根据术后恢复运动运动情况,分为观察组54例(术后恢复运动)和对照组19例(术后未恢复运动),采用单因素及多因素logistic回归分析用于确定术后恢复运动的影响因素。结果单因素分析结果显示美国麻醉师协会(American society of anesthesiologists,ASA)分级、肥胖(体重指数≥28kg/m2)、年龄>60岁、术前参加体育运动及手术方式均是术后恢复运动的影响因素(P<0.05)。多因素logistic分析结果显示ASA分级较高、肥胖与年龄>60岁对患者术后恢复运动不利(P<0.05),而术前参加体育运动对患者术后恢复运动有利(P<0.05)。结论ASA分级较高、肥胖、年龄>60岁对患者胫骨高位截骨术后恢复运动不利,而术前参加体育运动对患者胫骨高位截骨术后恢复运动有利。     

骨髓间充质干细胞归巢促小鼠骨折愈合的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移归巢在骨折愈合中的作用。方法 6周龄健康成年雄性清洁级C57/BL小鼠65只,体重17~25 g,采用外力冲击方法制备闭合性股骨骨折内固定模型,7 d后将小鼠分为3组:间充质干细胞(MSC)组(n=35)尾静脉注射生理盐水0.5 mL,0.5 h后注射内含1×106个红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞(RFP-BMSC)溶液0.5 mL;1,4,8,11-四氮杂环十四烷(AMD3100)组(n=15)尾静脉注射1 mmol/L AMD3100(CXCR4受体的特异性阻断剂)0.5 mL,0.5 h后注射内含1×106个RFP-BMSC的溶液0.5 mL;对照(CON)组(n=15)尾静脉注射生理盐水0.5 mL,0.5 h后再次注射生理盐水0.5 mL。造模成功后14、28、42 d采用冰冻切片荧光示踪法观察MSC组小鼠RFP-BMSC归巢情况,并在28 d后采用免疫荧光法观察BMSC位置和骨桥蛋白(OPN)及骨钙素(OCN)的表达;14、42 d后分别采用HE染色和Masson三色染色观察3组组织切片骨痂形成情况,并进行组织病理学检查及生物力学检查,评价3组骨折愈合情况。结果骨折后28 d MSC组有大量RFP-BMSC迁移至骨折处聚集,且高度表达OPN与OCN。14 d后病理组织切片染色结果显示,CON组与AMD3100组以软骨成分为主,而MSC组多已开始形成骨性骨痂;42 d后CON组与AMD3100组处于骨痂塑形期,皮质骨质量差,MSC组骨痂已基本塑形完成。生物力学检测结果显示,MSC组最大负荷、最大桡度、弹性桡度及刚度显著高于另两组(P<0.05),接近正常骨组织(P>0.05)。结论 BMSC归巢能促进骨折愈合,基质细胞衍生因子(SDF)-1/CXCR4通路在其中发挥重要作用。