PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究

目的为鉴定新分离毒株是否为B病毒.方法根据ScinicarielloF报道的引物,用PCR方法扩增BV147、HSV-1、HSV-2,对扩增产物进行SacⅡ内切酶消化.结果这一对引物可同时对这3种病毒进行扩增,但只有BV147的扩增产物可被SacⅡ内切酶切开.对BV147扩增片段克隆测序的结果证实,其与美国B病毒E2490株部分基因(UL27)相对应位置的核苷酸同源性为100%.结论初步建立了检测B病毒DNA的PCR方法并测定了新分离病毒毒株的部分基因序列,证明新分离的病毒为B病毒.     

维生素C对人类免疫缺陷病毒灭活作用的研究

目的验证维生素C对人类免疫缺陷病毒(HIV)的灭活作用,为生物制品提供一种安全可行的HIV灭活的方法。方法通过测半数组织培养感染剂量(TCID50),检测不同浓度维生素C在不同温度和作用时间下对HIV的灭活作用,并对有效剂量组进行MT4细胞毒性试验。结果500μg/ml维生素C在无血清状态下有灭活HIV作用,而此剂量对MT4细胞有不可逆转的毒性作用。结论维生素C不适宜用于血及血制品的HIV灭活。     

北京男男性行为人群HIV-1序列和流行趋势分析

目的 分析北京MSM人群HIV序列特征,预测北京该人群中HIV流行趋势。方法 汇总本实验室获得的北京MSM人群HIV序列,下载Los Alamos HIV Database中我国MSM人群及其他人群中流行的HIV序列,利用PhyML 3.0、BEAST等软件重建北京MSM人群系统发育树、估算突变速率、推断tMRCA、重建群体流行动态参数、计算再生指数R₀值,分析北京MSM人群与其他人群HIV流行的相关关系,推断进化和流行特征。结果 北京MSM人群中流行的HIV-1亚型包括B、CRF01_AE和CRF07_BC。在全国HIV毒株ML进化树中,北京MSM簇(北京MSM人群所占比例≥40%)共有3簇,即B-1簇、CRF01_AE-1簇、CRF01_AE-2簇。B1簇毒株是由至少3次传入事件进入北京MSM人群的,传入时间分别为1991年3月(1984年7月至1997年2月)、1994年1月(1989年1月至1998年1月)、1991年4月(1984年8月至1996年8月)。CRF01_AE毒株由2次传入事件进入北京MSM人群,传入时间分别为2000年12月(1998年3月至2003年1月)和2001年12月(2000年1月至2003年7月)。流行特征重塑分析显示,CRF01_AE-1簇近年来增长速度较快、突变速率较高。结论 北京MSM人群中存在多种HIV亚型毒株流行,其中B亚型毒株传入时间最早,但增长趋势趋于平稳;CRF01_AE毒株传入时间较晚、但增长迅速,对HIV在北京地区的流行具有明显的推动作用,因此对CRF01_AE毒株的防控有助于减少该地区HIV的流行。     

~(60)钴辐照法对生物羊膜中人类免疫缺陷病毒灭活效果的研究

目的研究60钴辐照法对生物羊膜中污染的人免疫缺陷病毒灭活效果。方法采用细胞培养法,对辐照法灭活生物羊膜中人工污染HIV-1ⅢB病毒效果进行观察。结果经辐照剂量为25 k Gy处理,可使污染在生物羊膜制品的HIV-1ⅢB病毒滴度下降6.5个log以上。处理后生物羊膜制品经细胞培养盲传三代,均未出现细胞病变。结论 25 k Gy辐照法能够完全灭活生物羊膜产品中污染的人免疫缺陷病毒。     

用M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达HIV-1 gp41抗原表位

目的:探讨M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达融合蛋白的可行性。方法:以纯化的HIV-1感染者血清多克隆抗体为配体,在噬菌体展示随机十二肽库中进行生物淘洗,经ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序,确定优势表位。将优势表位及两个优势表位的串联体分别与M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域连接,克隆入PQE30载体进行蛋白表达,再以表达蛋白为抗原检测HIV-1感染者血清中的抗体。结果:成功筛选到位于HIV-1 gp41蛋白上的3组优势抗原表位(HGPKDAETTAIW;AAFKDNQLLRIW;AAFKDNQLTRIW),3组优势表位及表位串联体(YGPKDAETTAIW-GGGS-SCSAKFTCTTQI)在PQE30载体中实现可溶性融合表达。重组蛋白具有良好的抗原性,能与不同的HIV-1抗体阳性血清呈特异反应。结论:用M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达HIV-1 gp41抗原表位是可行的。     

艾乃吉Ⅰ号抗艾滋病的实验研究

目的:观察艾乃吉Ⅰ号促进免疫功能及体外抑制HIV作用。方法:采用腹腔注射环孢酶素法建立免疫抑制模型小鼠,给药两周后取血,流式细胞仪上检测外周血淋巴细胞亚群;采用CPE法测定HIV对MT-4细胞的感染性滴度,MMT法测定药物对MT-4细胞的半数毒性浓度,CPE法测定药物的抗病毒活性,计算治疗指数。结果:艾乃吉Ⅰ号对提高免疫抑制小鼠CD3T细胞百分率和CD4T细胞百分率有一定作用,其中低剂量组与模型组比较CD4T细胞百分率的提高较为明显(P<0.05);在MT-4细胞/HIV-1ⅢB和实验系统,艾乃吉Ⅰ号抑制病毒复制的治疗指数是2.6。结论:艾乃吉Ⅰ号具有一定的促进免疫功能恢复及体外抑制HIV作用。     

HIV滤纸型质控品洗脱液的选择与应用

目的:制备容易保存的以滤纸为载体的HIV抗体质控品,研究不同洗脱液的洗脱效果及稳定性.方法:取相同的质控品原液制备10μl体系的液态型质控品和滤纸型质控品.液态型质控品使用时加入490μl正常人血清,滤纸型质控品分别用生理盐水组、血清组、PBS组、PBS-TW20组和样品稀释液组等不同稀释液进行溶解,对其质控测定值和稳定性进行研究.结果:5组不同稀释液溶解的滤纸型质控品检测结果与传统的液态质控品相比均无显著性差异(P>0.05).但生理盐水组和PBS组所得数值与液体型最符合,并且在l周内具有较好的稳定性和均一性.结论:滤纸型质控品可替代液态质控品用于HIV初筛实验室的室内或室间质控.采用容易获得的生理盐水作为滤纸型质控品的洗脱液,具有较好的稳定性和准确性.     

ASPCR检测微量HIV-1 K103N耐药突变方法的建立

目的 建立检测微量HIV-1 K103N耐药突变的等位基因特异扩增实时定量PCR(allele-specific real-time PCR,ASPCR)方法,用于微量K103N耐药突变的检测和分析.方法 首先建立检测K103N耐药突变的ASPCR方法,然后对方法进行验证,最后采用ASPCR方法检测对照样本.构建含K103N突变的质粒作为标准品,然后设计特异性引物用以区分野生型和突变型模板,采用SYBR green法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线.分别采用特异性和非特异性引物扩增模板,根据二者Ct(cycle threshold)值结合相应的标准曲线判断是否存在K103N突变及突变比例.对ASPCR检测K103N突变位点的特异性、敏感性、准确性、重复性等进行验证.结果 特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差(△Ct)可达13.56;当突变比例小于0.1%时仍具有良好的准确性;批内变异系数小于0.7,批间变异系数小于1.6;检测灵敏度可达0.01%.检测阴性对照样本的△Ct显著高于临界值,阳性对照样本检测结果均为刚性.结论 ASPCR是一种快速、灵敏、准确的检测HIV-1微量耐药突变的方法,可为临床抗病毒治疗提供理论指导.     

HIV抗体不确定标本的鉴别诊断研究

目的 阐明HIV抗体不确定结果的血清学特征,比较条带免疫印迹法(LIA)、HIV病毒载量(VL)和HIV-lp24抗原检测3种实验方法对HIV不确定标本的鉴别效果,明确蛋白免疫印迹法(WB)的非特异性发生率,为修订我国艾滋病检测技术规范提供依据.方法 检测56例HIV抗体不确定病例的92份标本,以随访后的HIV血清学状况为金标准,判断不同的方法在鉴别不确定结果方面的效果.结果 92份标本中有88份呈现14种不确定的条带模式,p24、gp160以及gpl60p24是最常见模式,其余9种呈散在分布,31例中27例随访阴性,4例发生HIV抗体阳转,阳转率26.7%;WB的非特异反应率87.1%,LIA的非特异反应率为3.2%,病毒载量的检测未出现非特异性反应,HIV-1 P24抗原的漏检率为9.2%.结论 只有出现gp160+p24带型的病例发生HIV抗体阳转,其余带型均表现为非异性反应,LIA、VL两种方法能够有效地判断现有的HIV不确定标本的感染状况.