深圳市耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变特征分析

目的 利用全基因组序列分析方法研究深圳市耐多药结核分枝杆菌(MDR-MTB)的耐药基因突变类型特点,为耐药结核病的快速分子检测提供依据。方法 对2013—2017年深圳市慢性病防治中心及各区慢性病防治院门诊收集的所有449株MDR-MTB临床分离株进行全基因组测序,经与结核分枝杆菌标准菌株(H37Rv)基因组模板序列比对后获得447株满足分析要求的全基因组测序菌株。每株菌株经单核苷酸多态性(SNP)鉴定后与H37Rv各基因型和亚型的特异性突变和对11种抗结核药品已知的耐药基因突变进行比对,获得各菌株独属的基因型或亚型和耐药基因突变,并分析不同药品耐药基因中的主要耐药突变类型不同基因型或亚型间的相关性。结果 447株MDR-MTB中全基因组测序结果显示,432株(96.6%)发生基因突变,MTB对11种药品主要的耐药突变类型分别为katG-315-S/T[INH, 81.7%(353/432)]、rpoB-450-S/L[RFP, 59.7%(258/432)]、rpsL-43-K/R[Sm, 66.0% (198/300)]、embB-306-M/V[EMB, 35.5% (94/265)]、pncA启动子-11-T/C[PZA, 8.9% (11/123)]、gyrA-90-A/V [Ofx, 31.5% (39/124)]、rrs-1401-A/G[Am,48.1% (25/52)]、rrs-1401-A/G [Cm, 100.0% (27/27)]、rrs-1401-A/G [Km, 84.4% (27/32)]、inhA-15-C/T[Eto, 84.2% (48/57)]、thyA-75-H/N[PAS, 31.3% (10/32)],且发现存在2种及2种以上联合突变者有对INH、RFP、EMB和Sm耐药的菌株。深圳市MDR-MTB菌株的3个基因型为L1[0.4%(2/447)]、L2[84.6% (378/447)]和L4[15.0%(67/447)]型,其中L2型又分为3个亚型[L2.1型:1.9%(7/378)、L2.2型: 37.0%(140/378)、L2.3型: 61.1%(231/378)]。突变类型为katG-315-S/T、rpsL-43-K/R和embB-306-M/V在L2型菌株中的突变率[分别为79.6%(301/378)、50.5%(191/378)、23.0%(87/378)]明显高于L4型菌株[分别为61.2%(41/67)、10.4% (7/67)、10.4% (7/67)](χ ²值分别为10.874、37.021、5.396,P值分别为0.001、0.000、0.020),且PAS耐药突变类型folC-43-I/T和thyA-75-H/N仅出现在L2型菌株中;其中katG-315-S/T在L2.2型菌株中突变频率[88.6%(124/140)]高于L2.3型[74.5%(172/231)](χ ²=10.764,P=0.000),而inhA-15-C/T(INH)、rpoB-450-S/L、rpsL-43-K/R和inhA-15-C/T(Eto) 在L2.3型菌株中的突变频率[分别为8.2% (19/231)、61.9%(143/231)、 59.3% (137/231)、15.6% (36/231)]明显高于L2.2型[分别为2.9% (4/140)、49.3% (69/140)、37.9% (53/140)、3.6% (5/140);χ ²值分别为4.319、5.668、16.053、12.797,P值分别为0.038、0.017、0.000、0.000)]。结论 深圳市MDR-MTB菌株中11种药品耐药基因主要突变类型分别为katG-315-S/T、rpoB-450-S/L、rpsL-43-K/R、embB-306-M/V、pncA启动子-11-T/C、gyrA-90-A/V、rrs-1401-A/G、inhA-15-C/T、thyA-75-H/N;基因型为L1、L2和L4型,以L2.2型、L2.3型和L4型为主。     

胶体金免疫层析法检测结核分枝杆菌特异性IgG/IgM抗体对结核病诊断的应用价值

目的 评价胶体金免疫层析法检测血清中结核分枝杆菌特异性IgG/IgM抗体在结核病诊断中的应用价值。方法 收集结核病患者和健康人的血清样本共332份及其背景资料,采用胶体金法检测血清中特异性结核抗体IgG/IgM,与临床诊断和细菌学检测结果比较,使用SPSS 22.0统计软件对结果进行比较分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果 胶体金免疫层析法检测结核病患者中特异性结核抗体IgG/IgM的灵敏度为41.15%、特异性为91.67%,检测菌阳和菌阴结核病患者的敏感性分别为51.38%和33.77%。在全部结核病患者中,特异性结核抗体IgG/IgM检测检出率(41.15%)显著高于痰涂片法(18.84%)和痰菌培养法(36.15%)(P<0.05)。结核抗体检测、痰涂片法和痰培养法三种方法联合检测阳性率为61.54%,高于单种方法检测或其中两种方法联合检测。结论 胶体金免疫层析法检测血清中结核分枝杆菌抗体具有灵敏、特异、快速和简便等优点,可用于结核病的筛查,同时该方法也具有一定的局限性,敏感度和特异度有待进一步的提高,因此不可单独用于诊断结核病,可配合痰细菌学、影像学和临床表现等进行辅助诊断。     

结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药分子特征的初步研究

目的 探讨结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药性与alrA、ddlA和cycA基因突变的关系,分析环丝氨酸耐药与基因型的关联性。方法 从菌株库中选取145株临床分离株,采用比例法测定菌株对环丝氨酸耐药表型、微孔板刃天青显色法测定最小抑菌浓度,PCR扩增、DNA直接测序法测定目的基因全长,与标准菌株H37Rv比对。间隔区寡核苷酸基因分型（spoligotyping）进行菌株基因型鉴定,分析耐药表型与基因型的关系,采用χ²检验分析差异有无统计学意义。结果 145株临床分离株中,环丝氨酸耐药菌株为24株,敏感株为121株。24株耐药菌株中,3株（12.5%）发生cycA非同义突变,涉及的密码子为188位、318位和508位,1株（4.2%）发生alrA非同义突变,涉及密码子为261位。敏感菌株的目的基因中仅检出同义突变。药敏试验证实,突变株的最小抑菌浓度均有不同程度的升高。北京基因型为88株,环丝氨酸耐药率为20.5%（18/88）,非北京基因型为57株,环丝氨酸耐药率为10.5%（6/57）,两者耐药率差异无统计学意义（χ²=2.47,P>0.05）。结论 alrA和cycA单核苷酸非同义基因突变可能是环丝氨酸耐药的机制之一。尚不能确定北京基因型或非北京基因型菌株与环丝氨酸耐药有相关性。     

结核分枝杆菌4种新抗原的克隆表达及血清学评价

目的 初步评价结核分枝杆菌4种新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c和Rv1547的血清学诊断价值。方法 以结核分枝杆菌实验室标准参照菌株H37Rv全基因组DNA为模板PCR扩增Rv0432、Rv0674、Rv1566c基因的完整序列,Rv1547基因分为两段（Rv1547-1和Rv1547-2）扩增,与PET-32a表达载体构建重组质粒,重组蛋白利用亲和层析的方法进行纯化。待检测血清和BL21（DE3）菌体蛋白孵育进行预处理。各重组抗原用ELISA对151份待检血清（41份健康组血清和110份细菌学阳性结核患者组血清）进行IgG抗体检测。检测结果用受试者工作特征曲线对其诊断效能进行分析和评价。采用t检验比较目的蛋白在结核患者组和健康组的差异性。结果 成功克隆表达和纯化了蛋白Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2,ELISA结果显示Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数和曲线下面积分别为43.64%~92.73%、80.49%~92.68%、0.92~0.94、0.38~0.80、0.363~0.732和0.649~0.915。目的蛋白在结核组检测到的IgG抗体水平均大于健康组（P<0.000 1）。结论 结核分枝杆菌新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2具有良好的血清学检测价值,可作为结核病免疫学诊断的候选抗原。