增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)自身增强子Ⅰ(enhancerⅠ,ENHⅠ)对HBVDNA疫苗免疫应答的影响。方法采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原(HBsAg)和HBsAg-ENHⅠ基因片段,重组到载体VR1012中,构建两种HBVDNA疫苗,转染COS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB/c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHⅠ的HBVDNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高,两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异;免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHⅠ可使HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加,对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB/c小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

人甲胎蛋白转录调控序列的研究进展

人甲胎蛋白(AFP)基因的转录受控于5'-侧翼序列的三种调控区域,即启动子、增强子和沉寂子.AFP启动子是一个典型的肿瘤特异性的启动子,非常适宜于肝细胞癌(HCC)基因治疗,但由于它作用比较弱,在决定胎儿肝脏和HCC的AFP表达水平上,发挥主要作用的是增强子.如何增强人AFP转录调控序列的转录活性,是当前HCC靶向基因治疗研究的重要方面,本文对该三种调控区域的研究进展和应用作一综述.     

WT1基因增强子构建位点对WT1基因启动子转录活性的影响

目的：以WT1基因启动子和增强子的功能片段为研究对象，探讨增强子构建在质粒的不同位点对基因启动子转录活性的影响。方法: 利用基因重组技术将WT1基因增强子的功能片段分别插入在已含有WT1基因启动子的质粒，pEWP的不同位点（MCS中的BamH I、EGFP 终止密码后的Not I和SV40polyA位点后的AflⅡ）中，将重组质粒转染慢粒白血病红白急变细胞株K562细胞、乳腺癌细胞株MCF-7细胞和人类胚胎肾转化细胞株293细胞，通过检测转基因细胞中EGFP的平均荧光强度来评估增强子对启动子的转录促进作用。结果: 通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体，即pEWP，和含有WT1基因启动子和增强子的载体，即pEWPE、pEWPD和pEWPA。流式细胞仪检测EGFP的平均荧光强度，发现pEWPA在293细胞和K562细胞中能够增强WT1启动子的转录活性，而pEWPE和pEWPD则无增强作用。3者均不能在MCF7细胞中增强WT1启动子的转录活性。结论: SV40polyA位点后插入增强子能够有效地增强启动子的转录活性，且具有细胞特异性。     

癌胚抗原启动子控制基因靶向表达研究

目的 构建由癌胚抗原(CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的重组表达质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP.了解CEA启动子靶向驱动的含目的基因的重组质粒的效率.方法 构建重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP,以PCR,DNA测序及酶切进行鉴定.通过脂质体介导重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP体外分别转染A549细胞(CEA阳性)和16HBE(CEA阴性)细胞,进行绿色荧光蛋白检测分析基因表达的靶向性.结果 CMVE-pCEA-IRES-EGFP分别用VSP Ⅰ,VSP Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切后电泳分别出现大小约405 bp,372 bp和4110 bp的片断,与预计各片断大小相符.以CMVE-pCEA-IRES-EGFP为模板PCR扩增得到CMV和CEA片段,分别连于T载体(pMD18-T)并测序,结果正确.嵌合启动子CMVE-pCEA能特异地驱动下游报告基因在CEA阳性肺癌细胞株绿色荧光表达阳性,而CEA阴性细胞株16HBE表达阴性.结论 成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA驱动的CMVE-pCEA-IRES-EGFP重组质粒,并能在转染的CEA阳性细胞株中表达,为靶向启动双基因表达载体构件提供了实验依据.     

Iα1基因hs1,2 区B等位基因与IgA肾病的易感性相关

［摘要］ 目的：研究Iα1 hs1,2 VNTR多态性与我国IgA肾病的相关关系。 方法： 采集419例肾活检证实的IgA肾病患者及其一级亲属、条件相当的201例健康志愿者血样，提取基因组DNA。用PCR产物直接电泳法鉴定Iα1 hs1,2 VNTR基因型，采用以家庭为基础的传递/不平衡分析（TDT）和单倍型相对危险度（HRR），以及病例-对照研究分析Iα1 hs1,2 VNTR多态性与我国IgA肾病的相关关系。 结果： ① TDT分析结果显示Iα1 hs1,2 VNTR B等位基因从杂合子父母向患者传递的频率显著高于预期值(101 Trios, χ2=6.818, P＜0.01，扩展TDT分析也得到相同结果(164家庭, χ2=7.583, P＜0.01)。②与TDT结果一致，HRR分析同样显示Iα1 hs1,2 VNTR B等位基因的过度传递 (P＜0.05, χ2=4.122, HRR=1.180)， 而BB基因型具有更强的患病倾向 (P＜0.05, χ2=4.411, OR=1.538)。③病例-对照研究显示IgA肾病组B 等位基因频率显著高于正常对照组(χ2=6.968, P＜0.05)。 结论： Iα1 hs1,2 VNTR基因多态性与我国IgA肾病患者的易感性相关。     

组蛋白甲基化酶EZH2对人肥大心肌细胞AC16增殖和凋亡的影响

目的:探究组蛋白甲基化酶zeste基因增强子同源物2(EZH2)对人肥大心肌细胞AC16增殖和凋亡的影响。方法:通过在AC16细胞培养基中添加血管紧张素Ⅱ构建AC16肥大心肌细胞模型,细胞分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ组、空载+血管紧张素Ⅱ组和EZH2过表达+血管紧张素Ⅱ组,并通过荧光定量PCR法检测EZH2和脑钠肽(BNP)基因的表达水平,Western Blot法检测EZH2、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27me3)和BNP蛋白的表达水平,MTS法检测AC16肥大心肌细胞增殖,以及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与空白对照组相比,血管紧张素Ⅱ组EZH2和H3K27me3表达水平降低,BNP的表达水平升高,细胞增殖降低,凋亡水平升高(均P<0.001);与空载+血管紧张素Ⅱ组相比,EZH2过表达+血管紧张素Ⅱ组EZH2和H3K27me3表达水平升高,BNP的表达水平降低,细胞增殖水平升高,凋亡水平降低(均P<0.001);血管紧张素Ⅱ组和空载+血管紧张素Ⅱ组相比上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:组蛋白甲基化酶EZH2对AC16细胞的增殖和凋亡具有影响,为心肌肥厚的治疗以及揭示心肌肥厚的发病机制提供参考。     

原核增强子对肿瘤坏死因子表达的研究

目的：探讨增强子样序列能否增强肿瘤坏死因子的表达;方法：将一大肠杆菌增强子M片段插入质粒PATNF153B（含人工合成的51bp增强子序列BELE,trp启动子及TNF基因）中,测定TNF基因的生物学活性;结果：活性测定结果表明,重组质粒PATNF153BM（＋）的TNF基因的生物学活性为质粒PATNF153B的2倍;结论：增强子M片段与51bpBELE具有协同作用,能增强肿瘤坏死因子的表达,具有重要的临床价值。     

肝癌细胞核蛋白对白蛋白增强子／启动子序列的体外转录调控作用

目的：研究肝癌细胞核蛋白调控白蛋白＂持家基因＂转录调控序列对目的基因转录的作用。方法：分别从小鼠肝癌细胞、肝细胞和黑色素瘤细胞中提取核蛋白组分,用于体外启动白蛋白增强子／启动子的转录作用。结果：发现某些肝癌细胞和肝细胞核蛋白组分具有明显的转录作用,而细胞浆蛋白和其他肿瘤核蛋白组分没有转录作用,将同一肝癌细胞某些核蛋白组分合并可使转录活性增强。结论：本研究在基因转录调控水平部分解释了应用白蛋白增强子／启动子调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的机理。