IL-17抑制大鼠肾脏成纤维细胞NRK-49F向肌成纤维细胞转化

目的:研究白细胞介素-17(IL-17)对大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F)转化为肌成纤维细胞?表达细胞外基质的影响,并进一步探讨该调节作用可能涉及的分子机制?方法:以转化生长因子β(TGF-β)诱导培养NRK-49F细胞,采用Western blot检测IL-17对NRK-49F表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白的影响;并运用real-time PCR分析NRK-49F 在诱导培养24?48?72 h后细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达水平及IL-17的调节作用?最后,运用Western blot检测细胞内Smad与非Smad通路中相关信号分子的表达及其磷酸化水平,以解释IL-17对NRK-49F 调节作用的分子机制?结果:IL-17抑制NRK-49F细胞表达α-SMA,并抑制其表达细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白?当IL-17对NRK-49F发挥上述抑制作用时,并未影响经典Smad 信号分子的表达,而是通过抑制非Smad通路Akt-TSC2-p70S6K的活化来实现的?结论:IL-17通过抑制TGF-β的非Smad通路Akt-TSC2-p70S6K的活化,从而抑制NRK-49F转化为肌成纤维细胞,并抑制其表达细胞外基质?     

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的： 构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I,HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor,Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法： 利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果： 限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论： 成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?     

Sublytic C5b-9诱导肾小球系膜细胞产生的TSP-1和TGF-β1对其合成FN和collagen Ⅳ的影响

目的:探讨亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)后,诱生的血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对其促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM),如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和 Ⅳ 型胶原蛋白(collagen Ⅳ)合成的影响?方法:体外培养大鼠GMC,进行不同分组处理并给予sublytic C5b-9刺激,然后分别检查受刺激的GMC合成TSP-1和TGF-β1因子水平,同时检测GMC分泌FN和collagen Ⅳ的水平?此外,应用人工合成的TSP-1封闭肽段(GGWSHW)和TGF-β1中和抗体处理培养的大鼠GMC,研究TSP-1和TGF-β1在sublytic C5b-9诱导的GMC分泌上述ECM中的作用及其相互关系?结果:培养的大鼠GMC在sublytic C5b-9刺激后18 h,其FN和collagen Ⅳ表达水平均明显升高?同时,TSP-1蛋白表达和TGF-β1分泌(包括活化的TGF-β1含量)也显著增多?用TSP-1封闭肽段(GGWSHW)处理大鼠GMC后亦能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化,并减少FN?collagen Ⅳ的产生?同样用TGF-β1中和抗体处理GMC后也能明显抑制由sublytic C5b-9导致的FN?collagen Ⅳ的分泌?结论:体外用sublytic C5b-9刺激大鼠GMC,能诱导其ECM分泌与TSP-1和TGF-β1的合成及活化,而sublytic C5b-9促进GMC分泌ECM的机制可能与其诱导TSP-1合成及活化的TGF-β1存在一定的关系?     

大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?     

医学免疫学教学的经验与体会

医学免疫学是医学本科生教育的必修科目之一,既是基础医学的重要课程,又是生命科学的前沿学科,其重要性不言而喻.然而医学免疫学概念繁多、内容抽象、理论复杂,是公认的难教、难学的课程之一.在几年的教学实践中,从改进教学方法入手,积极探索解决上述难点的方法,取得了初步成果和体会.将这些体会总结出来,以期为今后的教学实践提供意见和参考.     

基因芯片筛选抗胸腺细胞血清性肾炎大鼠肾组织基因表达差异的初步研究

目的： 利用基因芯片检查大鼠系膜增生性肾炎，即抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)模型大鼠发病 40 min 和 5 d 时肾组织相关基因的表达情况，探讨ATSN大鼠不同时相肾组织基因表达的差异并作功能分析。 方法： 用抗胸腺细胞抗血清（ATS）复制大鼠ATSN模型，抽提发病 40 min 和 5 d 时肾组织RNA，分别用逆转录合成荧光分子掺入的cDNA作探针进行基因芯片杂交。用Agilent 扫描仪扫描，Imagene软件读取数据，最后用Genespring进行normalize处理和差异表达基因的筛选。差异基因筛选标准为实验组/对照组比值（ratio）>或=2为上调基因，实验组/对照组ratio<或=0.5为下调基因。然后选取上调和下调基因登录GenBank查找其相关功能。 结果： 在 9 234 个大鼠基因中（去除质控基因），ATSN大鼠 40 min 时肾组织上调基因为341个，其中部分为凋亡相关的调控基因，部分为增生相关基因及一些与信号转导有关的基因；下调基因为392个，其中一些是酶类基因，部分为生长因子和细胞因子受体基因等，其余大多上调和下调基因功能不详。ATSN发病 5 d 时，肾组织上调基因是213个，包括增生相关基因、信号转导相关基因等；下调基因119个，其中部分为酶类和细胞因子相关基因。5 d 时上调和下调基因大多功能不清楚。 结论： 大鼠ATSN发病早期（40 min），致病相关基因已被激活（如凋亡和增生相关基因），其中相关信号转导分子基因也表达上调，而在ATSN大鼠发病 5 d 时，基因表达谱有所改变，其中涉及的基因多为增生相关基因和信号转导相关基因。     

实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的改良

目的：提取并纯化正常人脑脊髓的髓磷脂碱性蛋白(MBP)，鉴定其活性，并用其诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型。方法：以人脑脊髓为原料，通过去脂、酸溶解、CM—52柱层析等步骤提取人MBP，鉴定其纯度后在Wistar大鼠诱导EAE。结果：所提取的MBP具有纯度高、免疫话性好的特点，与抗MBP抗体能特异性结合，并可成功地诱导出EAE动物模型，病理学证实发病大鼠的脑脊髓具有典型的脱髓鞘改变和胶质结节形成。结论：用人MBP在不加百日咳杆菌的条件下，同样可以诱导出EAE，这种动物模型体内的病理学改变与人类的多发性硬化症(MS)更具有相似性，适用于对MS的研究。     

靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默

目的设计以PCSK9基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对PCSK9基因表达的影响。方法将3条人PCSK9基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pLentilox3．7,与pCDNA3-hPCSK9．FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pCre—VSV-G、pLoxp．CMV—R8．91经293细胞包装后,产生的重组慢病毒感染293细胞,48h后转染pCDNA3．hPCSK9-FLAG质粒,Western blotting法检测人PCSK9基因表达的情况。结果经双酶切鉴定,构建了PCSK9shRNA慢病毒载体pLentilox—hPC—SK9,鉴定出hshRNA-2为最有效的shRNA。重组的慢病毒能明显的抑制人PCSK9的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性的阻断PCSK9的表达,为进一步探讨PCSK9特异性的shRNA治疗脂代谢异常疾病奠定了基础。     

足月胎盘单核-巨噬细胞体外诱导分化为树突状细胞

目的:研究人类足月胎盘中的单核-巨噬细胞是否能分化为树突状细胞(DCs).方法:机械分离足月胎盘中的单核-巨噬细胞,加入内皮细胞单层中,经正逆两次穿越内皮,48 h后收集返回到内皮单层上方得到的细胞,以扫描电子显微镜和普通光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型及3H-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖能力.结果:足月胎盘中的单核-巨噬细胞经过(逆)穿越内皮系统后,具有典型的DCs的形态学特征,相对于胎盘单核-巨噬细胞而言高表达CD80、CD86以及HLA-DR,并具有激发异体T细胞增殖能力.结论:足月胎盘中的单核巨噬细胞在内皮(逆)穿越系统中可以分化为DCs.