大量活性神经元细胞核的分离技术

背景：细胞分化、细胞融合乃至克隆均需要应用分离细胞核的方法以获得大量有活性的细胞核，但是目前很难在数量和质量上同时达到较高的水准。 目的：探索简单易行的分离细胞核的方法，为神经元细胞核移植、细胞拆合以及细胞核成分的研究提供大量完好有活性的细胞核。 设计、时间及地点：对比实验，于2006-09／2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成。 材料：Cytochalasin B为Sigma公司提供，清洁级SD孕大鼠来源于南京医科大学动物实验中心。 方法：取胎鼠大脑皮质，进行神经元的培养并鉴定。用Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法两种方法进行细胞核分离的对比观察。 主要观察指标：用碘化丙啶标记后进行流式细胞仪检测凋亡率并用免疫荧光染色对细胞核进行形态学观察。 结果：两种方法均成功地分离出大量有活性神经元细胞核，且梯度离心法可以得到较为完整的胞质体，与完整细胞细胞核荧光强度比较无显著性差异（P〉0．05）。 结论：Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法均能够有效地进行神经元细胞核的分离，且细胞核在短期内有较高的活性。     

人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和特性分析

目的:构建全人源抗人Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗体轻?重链表达载体,在293Free style 细胞中表达并纯化,分析该重组全分子抗体的生物学活性?方法:设计引物扩增全人源抗人TLR4抗体可变区编码序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hl中,共转染至293Free style 细胞,表达产物用protein A亲和层析柱纯化?应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)?Western blot?免疫共沉淀?质谱分析及蛋白芯片检测抗体的免疫学特性,并检测该抗体对人单核细胞淋巴瘤THP1细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达的影响?结果:成功构建全人源抗人TLR4抗体真核表达载体,获得的全分子抗TLR4抗体保持了与抗原的结合活性,对THP-1细胞TNF-α表达的抑制率可达85.7%?结论:重组全人源抗TLR4 IgG保持了与TLR4的结合特异性,并具有明显的中和作用,对炎症治疗具有潜在的应用价值?     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

细胞移植对脑出血脑损伤的保护作用

目前用于脑出血治疗研究的主要细胞有：神经干细胞、遗传工程神经干细胞、骨髓间质干细胞、脐血细胞、胚胎干细胞、重组细胞、微囊化人工细胞等，本文就前5种细胞移植在出血性脑损伤中的保护作用进行综述。干细胞移植在脑出血性动物身上的实验所取得的良好效果，显示细胞移植重建损伤的脑组织、改善脑功能成为治疗脑出血疾病的必然途径。临床实验也取得了一定效果，但要真正应用于临床目前还有许多问题要解决：要想准确的定向诱导细胞分化，需要更深入的研究局部微环境，细胞因子及基因对干细胞分化的作用；细胞移植促进脑出血功能的恢复，其确切的机制还需要进一步研究 ；诱导分化的神经干细胞是否能象正常神经细胞一样能分泌神经递质，是否具有复杂的电生理等。     

鼠源性单克隆抗体Met4用于检测胃癌组织Met的表达及临床意义

目的:观察研究肝细胞生长因子受体Met在胃癌组织及相对应的淋巴结转移灶中的表达水平,同时比较分析抗Met单克隆抗体Met4和多克隆抗体C28在检测Met表达水平中的差别?方法:采用免疫组织化学间接法检测胃癌组织芯片中Met表达水平,比较Met4与C28的检测效能?结果:Met在细胞膜及胞浆阳性表达率在不同病理分级组间无统计学意义(P > 0.05)?Met4组Met的阳性染色部位于细胞膜(浆),而C28组Met阳性染色部位在细胞浆中,二者在Met亚细胞染色定位上有差别?Met4的阳性检出率(58.3%)高于C28阳性检出率(30.5%),具有统计学意义(P < 0.05)?Met4组21例胃癌原发灶Met阳性病例中14例淋巴结转移灶Met表达阳性,C28组11例原发灶Met阳性病例中6例淋巴结转移灶Met表达阳性?原发灶中Met阳性表达与转移淋巴结中Met的阳性表达有显著相关性(P < 0.05)?结论:Met阳性表达可能在肿瘤的淋巴转移过程起重要作用?Met4用于肿瘤的诊断及靶向治疗,具有良好的临床应用前景?     

探讨不同实验条件对U87细胞体外增殖的影响

目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS法检测细胞增殖能力。结果:HDGF表达水平下调后,U87细胞增殖能力受到抑制。在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,细胞增殖抑制率分别是18%、9%和28%。结论:在无血清Matrigel胶预先处理的培养条件下,能最大程度上反映出HDGFsiRNA对U87细胞增殖能力的抑制。     

新民滩血吸虫病防治的成本-效益分析

新民滩位于江苏省高邮市境内，地处淮河入江水道中段，行洪断面10km，总面积4933．36hm^2，其中水面积733．34hm^2，滩面积4200．02hm^2。1976年达到了血吸虫病传播控制标准。高邮市在“八五”、“九五”期间，调动农业、水利、卫生等部门和群众的积极性，开展了“垦殖、治水和血防”相结合的综合治理措施，取得了“治虫、治水、垦殖致富”的结果。各项指标达到了血吸虫病传播阻断标准，并取得了良好的经济效益。本文对1991-2001年新民滩实施“垦殖、治水、血防”相结合的综合治理措施的成本（投入）与效益（产出）进行分析。     

日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化

目的为了提高单克隆抗独特型抗体NP30抗体检测系统在大山区日本血吸虫病疫区的诊断效能,在原有的双抗体夹心ELISA方法的基础上对其进行优化、改良,建立间接ELISA血清学诊断方法。方法通过正交设计,选用L27(313)正交表,对NP30腹水包被酶标板的浓度、血清浓度、血清孵育时间和辣根过氧化物酶标记抗人IgG的二抗孵育时间共4个因素的3个水平进行不同组合的实验,确定该间接法的最佳实验条件。并用建立的方法对50份云南大山区日本血吸虫粪孵阳性病人血清样本和50份非疫区正常人血清样本进行检测,评价其敏感性和特异性。结果确定的该间接法最佳检测条件为:NP30腹水4μg/ml包被酶标板,血清浓度为1∶100,37℃孵育60min,二抗为37℃孵育30min。该方法的敏感性和特异性分别为88%和96%。结论该方法具有较高的诊断价值,可用于大山区日本血吸虫病疫区的诊断检测。     

抗独特型抗体在寄生虫病领域的研究进展及应用

独特型及抗独特型抗体源自免疫网络学说,抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的作用.基于这一理论基础,抗独特型抗体已被J一泛应用于疾病的免疫诊断、疫苗及免疫治疗等方面的研究中.该义就抗独特型抗体的制备、鉴定方法以及其在寄生虫病领域中的研究进展进行综述.     

抗独特型抗体在寄生虫病领域的研究进展及应用

独特型及抗独特型抗体源自免疫网络学说,抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的作用.基于这一理论基础,抗独特型抗体已被J一泛应用于疾病的免疫诊断、疫苗及免疫治疗等方面的研究中.该义就抗独特型抗体的制备、鉴定方法以及其在寄生虫病领域中的研究进展进行综述.