秀丽隐杆线虫NDX-4蛋白的体外表达及酶学活性研究

目的 构建秀丽隐杆线虫NDX-4基因的克隆载体和表达载体,诱导NDX-4蛋白表达,研究NDX-4的体外酶学活性.方法 构建NDX-4的克隆载体,将NDX-4的开放阅读框架（ORF）插入PGEM-T载体中扩增;采用双酶切将NDX-4ORF连入表达载体pET-30a（＋）中;将连接质粒转入BL21（DE3）感受态细胞后,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）对NDX-4蛋白进行表达诱导,并进行树脂纯化;用SDS-PAGE和Western blot检测以评价NDX-4体外表达和纯化的质量;采用高效液相色谱-紫外检测技术（HPLC-UV）检测NDX-4蛋白水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的活性.结果 SDS-PAGE和Western blot 检测均在经IPTG诱导的蛋白提纯物泳道上出现单一条带,分子质量约为24kDa,而未诱导的和空载体均未见条带.HPLC-UV检测结果显示加入NDX-4蛋白的8-oxodGTP和8-oxoGTP均被水解为相应的单磷酸和二磷酸氧化核苷,并且随着蛋白量的增加,两种产物的量逐渐增多.结论 秀丽隐杆线虫的NDX-4蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的双重功能,可能对抑制DNA和RNA的氧化损伤具有重要意义.     

血液恶性肿瘤细胞系体外培养模型的建立

本研究旨在建立一套血液恶性肿瘤的体外细胞培养模型。构建几种带有GFP（绿色荧光蛋白）表达并能够编码不同白血病／淋巴瘤相关融合蛋白的逆转录病毒载体（如：TEL-PDGFR,Rabaptin5．PDGFR,p210BCR-ABL,AMLl一ETO,NPM-ALK）;将病毒载体导入小鼠的原始骨髓细胞,转导的骨髓细胞随后培养在含有10％FCS的IMDM中。将细胞分为：无生长因子组和含有不同生长因子的各种组合组：①c．kit联合fit3（KL＋FL）组,②IL-3＋TPO-4-G-CSF＋Hyper-IL-6（3／T／G／H6）组,③KL＋FL＋3／T／C／H6组。用流式细胞术检测肿瘤融合蛋白联合各种生长因子支持骨髓转导细胞的自我更新、扩增生长的能力。结果表明,转导的细胞能够持续对数级的生长扩增。KL联合FL能够支持转导编码TEL-PDGFR、Rabaptin5-PDGFR、AML1-ETO、NPM-ALK病毒载体的骨髓细胞自我更新、生长扩增;而转导p210BCR-ABL病毒载体的骨髓细胞除需要KL和FL外,还需要IL-3的参与。扩增培养的细胞形态与所对应的肿瘤基因相关的血液肿瘤细胞相一致。结论：本研究建立了一套体外模型培养体系,提供了一种研究血液恶性肿瘤的方法,可用于筛选血液肿瘤的治疗性药物。