T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的　探讨克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增产物的简便方法。方法　用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体 (UPAR)基因 ,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T -载体 ,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子。结果　设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区 (34 3bp)和UPAR基因编码区全长 (10 83bp) ;未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM -TEasy载体 ,其中正确重组率为 6 2 .5 %～ 87.5 % ;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达。结论　T -载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法。     

Dispersion of ventricular repolarization: Temporal and spatial

Repolarization heterogeneity(RH) is an intrinsic property of ventricular myocardium and the reason for T-wave formation on electrocardiogram(ECG). Exceeding the physiologically based RH level is associated with appearance of life-threatening ventricular arrhythmias and sudden cardiac death. In this regard, an accurate and comprehensive evaluation of the degree of RH parameters is of importance for assessment of heart state and arrhythmic risk. This review is devoted to comprehensive consideration of RH phenomena in terms of electrophysiological processes underlying RH, cardiac electric field formation during ventricular repolarization, as well as clinical significance of RH and its reflection on ECG parameters. The formation of transmural, apicobasal, left-toright and anterior-posterior gradients of action potential durations and end of repolarization times resulting from the heterogenous distribution of repolarizing ion currents and action potential morphology throughout the heart ventricles, and the different sensitivity of myocardial cells in different ventricular regions to the action of pharmacological agents, temperature, frequency of stimulation, etc., are being discussed. The review is focused on the fact that RH has different aspects – temporal and spatial, global and local; ECG reflection of various RH aspects and their clinical significance are being discussed. Strategies for comprehensive assessment of ventricular RH using different ECG indices reflecting various RH aspects are presented.     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体

目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM -T载体。方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM- 000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定, 再行测序分析。结果重组质粒PCR扩增得到1568 bp的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%。结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法, 可用于基因的检测和载体的构建。     

神经生长因子高亲和力受体 (Trk A) cDNA片段的克隆

目的：克隆大鼠背根神经节中NGF高亲和力受体基因。方法：从出生1周大鼠背根神经节中抽提总RNA，设计TrkA引物，进行RT—PCR扩增。扩增产物直接与T载体连接后转化E．coli DH5α，用蓝／白斑试验筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，再行序列分析。结果：经RT—PCR获得预期416bp的目的片段，T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实，克隆片段与Genbank中TrkA基因序列100％同源。结论；成功地构建了含TrkA基因cDNA的T载体克隆，该克隆可在一定侧面有助于在分子水平研究某些金属中毒导致的神经损伤。     

CYP1A1基因cDNA全长的T载体克隆及序列分析

目的构建含KpnI、XhoI双酶切位点的人细胞色素(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法从培养的人乳腺癌细胞(MCF-7)中抽提总RNA,RT-PCR扩增CYP1A1基因cDNA全长,与pGEM-T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析。结果重组质粒pGEM-T-1A1 PCR后获得了1 568 bp产物,酶切鉴定证实目的片段成功插入至pGEM-T,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1mRNA的序列同源性为99.9%。结论成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体。     

Construction of T-vectors

目的 :介绍一种省时、高效的构建 T-载体的方法。方法 :在完全消化质粒的 3末端加上一个胸腺嘧啶 ( T)。结果 :构建了两种 T-载体 :p GEM- 5Z和 pc DNA3。结论 :这种 T-载体可以非常有效地用于 PCR产物的克隆。     

特异基因的PCR扩增及其快速克隆

采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我们构建了新的克隆载体即T载体，专门用于克隆未经任何修饰的PCR产物；这种方法价廉，快速有效，值得推广应用。     

黑色素瘤抗原-1基因并进行序列分析

目的:克隆黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因并进行序列分析.方法:从人肝细胞性肝癌(HCC)组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出MAGE-1基因,酶切鉴定后将其插入pGEM-T easy载体,对其进行序列测定并与GenBank中已知序列进行同源性分析.结果:所克隆的MAGE-1基因与GenBank 中的MAGE-1基因序列相比较,仅有4个碱基存在差异,同源性为99.7%,而且仅有1处碱基差异引起了氨基酸改变.结论:从人HCC组织中成功克隆了MAGE-1基因.     

高效表达型T克隆载体的构建及其特性

目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体peDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（driP）70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）和中国旱獭α干扰素基因（cwIFNA5）分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80％以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFINA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1：640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。