pRNA纳米微粒对脊柱结核分枝杆菌生长影响的实验研究

目的 :观察pRNA-3WJ-siLNA gapmer(Mce4)-aptamer(CD40)纳米微粒(简称pRNA纳米微粒)在脊柱结核细胞模型中对结核分枝杆菌生长的影响。方法:利用荧光结核分枝杆菌感染人成骨细胞建立脊柱结核细胞模型。先培养及准备人成骨细胞,人成骨细胞培养至第三代;然后构建培养荧光结核分枝杆菌;将培养良好的人成骨细胞用1×Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化之后以70%密度在100mm细胞培养皿种植细胞,经24h培养使细胞稳定之后,将1麦氏比浊管的对数生长中期荧光结核分枝杆菌以感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10感染培养的人成骨细胞6h,用不加血清培养液清洗3次,在培养箱中培养24h;然后将感染成功的人成骨细胞随机分为A组(空白对照组)及B、C、D组(三个实验组),三个实验组分别置入本研究团队构建的0.1μM、1μM、10μM浓度的脊柱结核靶向治疗pRNA纳米微粒溶液,共培养36h之后,加入细胞裂解液裂解细胞,裂解产物用Middlebrook 7H9培养液稀释20倍,之后均匀涂抹到琼脂平板,放入到37℃,5%CO2细胞培养箱中培养21d,使用Gel Doc XR+system凝胶成像系统观察菌落影像,使用Bio-Rad Discovery Quantity One~?1-D analysis软件对四组的所有菌落进行了测定,统计分析各组人成骨细胞中结核分枝杆菌菌落形成单位(colony forming unit,CFU)。结果:人成骨细胞培养良好;成功构建荧光结核分枝杆菌(H37Ra-GFP);荧光结核分枝杆菌结合并进入人成骨细胞。经统计分析A、B、C、D四组菌落形成单位(272.67±67.06、183.33±8.74、154.33±25.72、76.67±11.02)的差异存在统计学意义(F=14.68,P0.05);且B、C、D三组的菌落形成单位分别与A组相比时,均明显低于A组(P0.05),B、C、D三组菌落形成单位依次下调,三组菌落形成单位两两比较存在差异,并且有统计学意义(P0.05)。结论:pRNA纳米微粒以浓度梯度的方式抑制结核分枝杆菌在人成骨细胞中的生长存活,甚至低浓度也具备抑制结核分枝杆菌生长的能力。     

CD40作为脊柱结核靶向治疗靶标分子的实验研究

目的:通过对不同感染复数结核分枝杆菌侵染的正常人成骨细胞表面CD40分子差异表达的实验研究,探讨CD40作为脊柱结核分子靶向治疗的靶标分子的可行性。方法:将冷冻保存的正常人成骨细胞按照美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)的说明进行复苏和培养,传代至3代冻存备用;之后选择Middlebrooke7H9液体培养基对荧光结核分枝杆菌(H37Ra-GFP)进行培养,培养至对数中期备用。把传代后的人成骨细胞随机分为A、B、C、D四组,A组为对照组,是未被结核分枝杆菌侵染的人成骨细胞组;B、C、D三组均为实验组,分别是被感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1∶1000、1∶100、1∶10浓度的结核分枝杆菌侵染的人成骨细胞组。然后采用实时定量PCR与蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)的方法,分别检测不同感染复数结核分枝杆菌诱导人成骨细胞中CD40 mRNA的表达变化及成骨细胞表面CD40分子的表达变化。结果:传代后的人成骨细胞经荧光结核分枝杆菌侵染后,观察发现各组细胞感染程度良好。A组实时定量PCR反应结果表现为人成骨细胞中存在CD40 mRNA的表达;A (1.0337±0.0715)、B (1.4083±0.1145)、C(1.7172±0.1294)、D(2.0378±0.1573)四组之间的表达存在差异(F=74.005,P0.05);B、C、D三组分别与A组相比时,均存在差异(P0.05),表现为结核分枝杆菌侵染组B、C、D三组成骨细胞中CD40 mRNA的表达均高于未侵染组A组;B、C、D三组,两两比较时,均存在差异(P0.05),表现为从B组到D组成骨细胞中CD40mRNA的表达依次上调。而通过蛋白免疫印迹法分析成骨细胞表面CD40分子的表达结果发现与上述m RNA表达上调的结果完全吻合。结论:结核分枝杆菌侵染人成骨细胞后可诱导成骨细胞中CD40 mRNA以及成骨细胞表面CD40分子的表达增多,并且感染复数越高,细胞表面CD40分子的表达越多。而CD40分子可与其所对应的核酸适体特异结合,这就为使用CD40分子作为靶标分子,对脊柱结核进行靶向治疗提供了理论基础。