New SD rat osteoblasts by modified explant culture in vitro and identification

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较.优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%.该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法.     

通脉养心丸联合替罗非班治疗不稳定型心绞痛的临床研究

目的探讨通脉养心丸联合盐酸替罗非班治疗不稳定型心绞痛的临床疗效。方法回顾性分析2018年10月—2020年10月在驻马店市中心医院治疗的122例不稳定型心绞痛患者临床资料,根据治疗方案的差异分成对照组(61例)和治疗组(61例)。对照组给予盐酸替罗非班氯化钠注射液,初始计量0.4μg/(kg·min),用药30 min后,继续以0.1μg/(kg·min)的速率维持滴注。治疗组在对照组基础上口服通脉养心丸,40丸/次,2次/d。两组均治疗10d。观察两组的临床疗效,比较两组治疗前后心功能指标、血清学指标和凝血指标的变化情况。结果治疗后,治疗组治疗的总有效率是98.36%,远高于对照组(81.97%,P<0.05)。经治疗,两组患者心输出量(CO)、每搏量(SV)、射血分数(EF)均显著提高(P<0.05);治疗后,治疗组患者心功能指标显著高于对照组(P<0.05)。经治疗,两组患者血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)、血清Ⅰ型胶原羧基端吡啶并啉交联肽(ICTP)、可溶性生长刺激基因表达蛋白2(sST2)、人可溶性细胞黏附分子(sICAM-1)、血清炎症脂肪细胞因子五聚素3(PTX-3)水平均显著下降(P<0.05);且治疗后治疗组血清学指标低于对照组(P<0.05)。经治疗,两组患者纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)水平均显著下降(P<0.05);且治疗后,治疗组FIB、D-D低于对照组(P<0.05)。结论通脉养心丸联合盐酸替罗非班治疗不稳定型心绞痛可有效提高患者临床疗效,改善患者心功能和血清学指标,有利于调节凝血指标,有一定的临床推广应用价值。     

牛黄熊脱氧胆酸抑制TNF-α刺激3T3-L1细胞脂肪分解

目的探讨牛黄熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)对TNF-α刺激3T3-L1细胞脂肪分解及其可能的机制。方法以3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,设:①对照组;②TNF-α(50 ng/ml)组;③TUDCA(1 mmol/L)+TNF-α(50 ng/ml)组;④TUDCA组(1 mmol/L)。通过油红O染色观察脂滴形态变化并测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标,同时用Western blot检测脂滴包被蛋白perilipinA蛋白表达。结果 TNF-α可以显著刺激3T3-L1细胞脂肪分解,包括功能学显示甘油释放量显著增加[(2.784±0.104)mmol/L,P<0.01],形态学显示脂滴碎裂;TUDCA可以明显抑制TNF-α刺激的3T3-L1细胞脂肪分解,包括阻止脂滴形态的改变,逆转甘油的释放[(1.718±0.085)mmol/L,P<0.01]。通过Western blot检测结果显示TNF-α可以下调perilipin A蛋白表达[(0.227±0.004),P<0.01],而TUDCA可以阻断TNF-α对perilipin A蛋白表达的下调作用[(0.705±0.066),P<0.01]。结论 TUDCA可能通过阻止perilipin A蛋白下调而抑制TNF-α诱发脂肪分解,通过减少游离脂肪酸FFA,从而对胰岛素抵抗、糖尿病等具有一定的改善作用。     

Effect of L-4F on monocyte chemoattractant protein-1 expression in 3T3-L1 adipocytes induced by oxidized low-density lipoprotein

目的 观察载脂蛋白A-I模拟肽L-4F对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞分泌表达单核细胞趋化蛋白-1( MCP-1)的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL(50 μg/ml)刺激脂肪细胞,给予L-4F( 1-50 μg/ml),H-89( 10μmol/L)及H-89+ L-4F(50μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞MCP-1上清液中的浓度和mRNA表达水平,以及脂肪细胞核因子C/EBPα、β的蛋白质水平;改良Boyden小室法检测不同干预组上清液对人外周血单核细胞趋化活性的影响.结果 OxLDL(50 μg/ml)刺激使分化成熟的3T3-L1脂肪细胞表达及分泌MCP-1明显增加,并使得诱导的单核细胞移动距离明显增加.L-4F以浓度依赖的方式减少脂肪细胞MCP-1的表达和分泌,降低单核细胞趋化活性;50 μg/ml L-4F使MCP-1 mRNA的表达降低(91±6)％(P＜0.01).PKA抑制剂H-89(10 μmol/L)干预oxLDL刺激的脂肪细胞后MCP-1 m RNA的表达也显著减少(P＜0.01),但是,在50μg/ml L-4F作用的基础上,H-89(10 μmol/L)的孵育并未使得MCP-1 mRNA的表达进一步降低(P＞0.05).50μg/ml oxLDL刺激对脂肪细胞C/EBPα的含量无明显影响,但增加C/EBPβ蛋白量,且该作用呈时间依赖性;L-4F和H-89干预均降低C/EBPβ的蛋白质含量.结论 OxLDL时间依赖性地诱导脂肪细胞C/EBPβ的蛋白合成,并增强脂肪细胞MCP-1的表达分泌,L-4F以浓度依赖的方式对抗oxLDL的致炎作用,cAMP/PKA-C/EBPβ信号通道可能是L-4F的作用途径之一.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外培养模型,并对其进行鉴定,为体外血管内皮细胞及相关疾病的研究搭建桥梁。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于M199培养基(含20%胎牛血清,80%M199不完全培养基,1%终浓度为50μg/mL内皮细胞生长复合物,1%终浓度为100μg/mL肝素钠,1%青-链霉素,1%L-谷氨酰胺)中培养,待细胞80%以上融合后,用0.25%的胰酶和0.25%的EDTA消化传代,并在倒置显微镜下观察细胞形态,用免疫荧光法对细胞进行鉴定。结果原代培养的HUVECs在24 h后完全贴壁,2～3 d可达80%的融合,倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排布,免疫荧光显示细胞胞浆中Ⅷ因子相关抗原阳性。结论 0.1%Ⅰ型胶原酶消化HUVECs方法便于操作,细胞获得量多且生长状态良好。     

新生大鼠原代心肌细胞的培养与鉴定

目的:探索简单易行、成功率高的心肌细胞培养方法。方法:取新生大鼠心脏心尖部剪成1 mm×1 mm×1 mm大小进行体外组织块贴壁培养。结果:成功培养出原代心肌细胞,并能够传代。心肌细胞台盼蓝染色显示存活率>87%,免疫组化染色鉴定纯度>90%。结论:通过上述方法可获得较高存活率及纯度的心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,符合实验需求。     

改良组织块结合胶原酶消化法培养食管癌细胞

目的：探讨食管癌细胞体外分离培养方法,建立合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。方法：应用改良的培养方法,即先将组织用机械法剪碎后再用胶原酶进行消化,对13例新鲜的食管癌组织进行体外培养,观察人食管癌细胞生长情况。结果：改良方法培养的细胞生长率为61%,污染率为15%。结论：改良组织块结合胶原酶消化法成功建立了较为合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。     

Visfatin对SW872脂肪细胞胰岛素信号分子蛋白表达的影响

目的:观察visfatin对胰岛素抵抗状态下的SW872成熟脂肪细胞胰岛素信号分子胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达的影响。方法:体外培养SW872前脂肪细胞,诱导细胞分化成熟,建立胰岛素抵抗模型,用含有100nmol/L visfatin的无血清培养液孵育1h后收获细胞,采用Western印迹法检测visfatin刺激前后信号分子IRS-1、IRS-2和PI3K的蛋白表达水平。结果:在正常状态下(正常组内比较),visfatin促进脂肪细胞IRS-1、IRS-2和PI3K的蛋白表达,分别增加了51.65%(P<0.01)、44.74%(P<0.01)和61.38%(P<0.01)。在胰岛素抵抗状态下,visfatin刺激组的IRS-1、IRS-2和PI3K的蛋白表达水平,分别比基础状态组增加了26.98%(P<0.05)、35.59%(P<0.05)、27.61%(P<0.01)。结论:在胰岛素抵抗状态下,visfatin通过调节脂肪细胞胰岛素信号分子IRS-1、IRS-2和PI3K蛋白表达而发挥促进葡萄糖转运、改善胰岛素抵抗的生物学作用。     

MR对小鼠原代棕色脂肪细胞功能的影响

目的:使用小鼠原代棕色脂肪细胞,研究盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)对其功能的影响?方法:使用MR激动剂醛固酮?MR拮抗剂螺内酯?糖皮质激素可的松分别作用于小鼠原代棕色脂肪细胞,观察棕色脂肪细胞相关基因的改变?结果:MR的配体(盐皮质激素)可显著增加其功能基因非偶联蛋白1(uncoupling protein-1,UCP1)?细胞死亡诱导DNA碎片因子-α-样效应结合区域蛋白(the cell death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector domain-containing protein,CIDEA)?过氧化酶增殖活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PGC1α)的表达,同时也促进分化基因脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)的表达,相反MR的拮抗剂可抑制棕色脂肪细胞功能基因的表达?另一方面, 盐皮质激素还可以协同糖皮质激素共同调节棕色脂肪细胞功能基因UCP1的变化?结论:MR是调控原代棕色脂肪细胞功能的重要因子?