人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景:骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的:探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计:以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象:实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法:构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标:主要结局:①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局:①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果:经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592&;#177;86.567)nkat/L与转染空载体(155.231&;#177;86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866&;#177;91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论:经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

植入神经的自体骨髓基质细胞-β磷酸三钙复合体修复兔长骨骨缺损

目的:评估在自体骨髓基质细胞-β磷酸三钙复合体内植入感觉神经、运动神经以及感觉神经、运动神经联合神经束的成骨效果,分析组织工程骨神经化与成骨的关系。方法:实验于2003-12/2005-03在解放军第一军医大学南方医院组织工程实验室完成。选取健康6月龄新西兰大白兔32只,取2只兔作为骨缺损空白组,剩余30只兔随机分为5组:组织工程骨组、感觉神经束植入组、运动神经束植入组、血管束植入组、感觉 运动神经束联合植入组,6只/组。①除骨缺损空白组外,其余5组兔均采用速眠新、氯胺酮和阿托品复合液肌肉注射麻醉制备组织工程骨。②各组兔均建立股骨1.5cm长骨缺损模型。从兔左后肢股骨前外侧纵切口,沿股直肌与股外侧肌间隙锐性分开进入,不切开骨膜,采用钢板和螺钉内固定。于钢板第2、3孔之间,以线锯锯断股骨一侧,用直尺测量股骨1.5cm长,标记好另一端截骨线,线锯截断,切除该段对应的骨膜,造成标准的1.5cm段缺性骨与骨膜缺损。③组织工程骨的神经支配重建:组织工程骨组于骨缺损处只嵌入β磷酸三钙 经诱导分化的骨髓基质细胞复合物;感觉神经束植入组将隐神经游离足够的长度,锐性切断后将隐神经束植入β磷酸三钙 经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内;运动神经束植入组解剖出由股神经发出的支配股内侧肌的肌支,游离一段长度后切断,将此神经束植入β磷酸三钙 经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内并加以固定;血管束植入组将股动脉游离所需长度后不切断血管,直接将血管束顺行植入β磷酸三钙 经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内;感觉 运动神经束联合植入组将隐神经和股神经肌支联合植入β磷酸三钙 经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内并加以固定。骨缺损空白组仅制作标准的股骨1.5cm段缺性骨与骨膜缺损,然后钢板内固定,骨缺损内不植入任何材料。④术后4,8,12周组织工程骨组、感觉神经束植入组、运动神经束植入组、血管束植入组、感觉 运动神经束联合植入组各处死2只兔,观察组织工程骨的表面变化、内痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。摄股骨正位X线片,用放射影像学评分和X线阻射影分析比较骨缺损修复情况。骨缺损空白组于术后12、18周各处死1只,摄片观察骨缺损愈合情况。结果:实验选取兔32只,全部进入结果分析。①细胞培养过程中倒置显微镜下观察结果:刚接种的骨髓中体积较大的单个核细胞呈球形,悬浮于培养液中。传代培养后3～4h开始贴壁,并逐渐向梭形细胞、多角型细胞转化,5～7d后细胞融合成单层,以后细胞可重叠生长,不发生细胞间的接触抑制现象,最后形成矿化结节。②术后各组大体观察结果:术后12周,组织工程骨组、运动神经束植入组材料大部分为骨痂所包裹,感觉神经束植入组骨缺损区为骨痂包裹,血管束植入组材料见骨缺损区为骨痂连接,感觉 运动神经束联合植入组骨缺损处为骨痂所充填,骨缺损空白组见骨缺损区有少量比较薄的骨痂,靠近两截骨端,骨缺损区为软组织包裹。③术后各组X线片观察结果:术后4,8,12周,感觉神经束植入组、血管束植入组、感觉 运动神经束联合植入组骨缺损区阻射影、材料吸收变化、截骨端愈合情况大体类似,但各组的成骨量与骨痂塑形均较组织工程骨组、运动神经束植入组出现早且截骨端愈合快。④术后各组植入修复骨缺损的放射影像学评分结果:与组织工程骨组、运动神经束植入组比较,感觉神经束植入组、血管束植入组、感觉 运动神经束联合植入组术后4,8,12周骨缺损区影像学评分均明显升高(P均<0.05),但此3组之间基本相似(P>0.05)。⑤术后各组植入骨缺损阻射密度测量值的比较:与组织工程骨组、运动神经束植入组比较,感觉神经束植入组、血管束植入组、感觉 运动神经束联合植入组术后4,8,12周骨缺损阻射密度相对值均明显升高(P均<0.05),但此3组之间基本相似(P>0.05)。结论:在组织工程骨中分别植入感觉神经束、血管束、感觉神经联合运动神经束后,可显著提高组织工程骨的成骨效果,但在组织工程骨中植入运动神经未明显增加组织工程骨的成骨作用。     

兔陈旧性关节软骨缺损模型的制备

背景:临床所见的骨性关节炎的软骨缺损大多为不规则的、深至软骨下的陈旧性骨缺损,但目前关节软骨缺损动物模型多为新鲜骨缺损.目的:观察制动时间和缺损大小对兔关节软骨陈旧性缺损的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004-04/2006-05在南方医科大学创伤骨科组织工程实验室完成.材料:6周龄新西兰大白兔6只,随机分为6,12周观测组两组,每组3只 6侧膝关节.干预:无菌操作下显露两侧股骨髁关节面,用牙科钻打圆形孔,每孔直径4 mm,深度约3 mm,达软骨下骨,术毕下肢固定,笼中自由喂养,后膝伸直位制动12周复制的膝关节陈旧性软骨缺损模型.主要观察指标:制动6,12周模型取出关节软骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察.结果:6只兔均进入结果分析.兔关节软骨及周围组织情况:12周时炎症反应较6周轻,纤维瘢痕化较6周明显;12周时出现增生性改变,尤其是关节周围的肌腱、关节囊、韧带、滑囊等结缔组织较6周时更易形成瘢痕、粘连、纤维化等陈旧性损伤组织学改变.12周后可见自行修复不完全,缺损明显.结论:构建的兔后膝股骨髁关节面软骨缺损直径4 mm,深度约3 mm,达软骨下骨,符合实验要求,适用于骨性关节炎的基础实验.     

手部多平面离断再植

手部多平面离断再植创伤重、伤情复杂、手术部位多、再植难度大、技术要求高 ,不同于一般断肢 (指 )再植 ,是断肢 (指 )再植中的一种特殊类型。本文针对手部多平面离断再植的特点 ,对其命名、分类、再植特征、手术特点、术后血循环监护、功能康复和晚期功能重建等方面进行了叙述与探讨     

骨组织工程中骨髓基质细胞的定向分化

骨组织工程中成骨细胞有四种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织，其中以骨髓为最优。因为骨髓基质细胞具有多向分化潜能，因此有必要选择最佳的培养条件来促进其增殖并定向分化为成骨细胞。可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的，其中以ＢＭＰ、ｂ－ＦＧＦ和ＴＧＦ－β的作用最为显著和直接。也可将各种生长因子的基因转人骨髓基质细胞，使其稳定有效地表达，通过自分泌和旁分泌作用来达到同样的目的。     

墨汁灌注和血管铸型方法检测山羊胫骨血管应用性能的不同

目的:比较血管墨汁灌注和甲基丙烯酸甲酯血管铸型两种方法在山羊胫骨血管检测中的优缺点,为组织工程骨血管化检测寻找一种直观可行的方法。方法:实验于2004-05/2005-07在南方医科大学南方医院创伤骨科骨组织工程实验室完成。①12只正常中国青山羊随机分为墨汁灌注组,甲基丙烯酸甲酯血管铸型灌注组,每组6只。②墨汁灌注组采用中华墨汁、甲醛及生理盐水体积比为3∶1∶6的复合墨汁,行双侧股动脉插管,经血管冲洗后进行灌注,低温放置24h后取下胫骨标本行进一步处理,甲基丙烯酸甲酯血管铸型灌注组,每只山羊均行双侧后肢股动脉插管,血管彻底冲洗后将预聚后的甲基丙烯酸甲酯灌注,低温放置24～28h后取下胫骨标本行下一步处理。③灌注后两组标本分别采用大体解剖,未脱钙骨磨片和脱钙后组织切片等方法观察青山羊胫骨血管的走行与分布。结果:①山羊胫骨经墨汁灌注后大体解剖、未脱钙骨磨片和脱钙骨组织切片观察可清楚显示骨膜、骨皮质和骨髓腔血管;可以观察骨组织的显微结构,但不便于直观地观察胫骨与周围血管的空间立体结构。②血管铸型后的山羊胫骨制作的大体解剖标本,在胫骨中段制作2cm×1cm骨窗,可见髓腔内的铸型血管,骨皮质横、纵切面上可见微细的铸型血管断面;可以直观的观察山羊胫骨与周围血管的空间立体构筑,显示胫骨营养血管的分布、走行,未脱钙磨片能够清楚显示骨皮质血管网,扫描电镜可以观察到哈佛氏管内血管。结论:血管墨汁灌注适合用于微血管检测,便于染色后同时观察骨组织的显微结构;而血管铸型标本则适合大体观察血管的空间立体构筑,较为直观,两者在组织工程骨血管化检测中有不同的应用价值。     

异体手移植急性排斥反应的成功预防

目的:探讨异体手移植急性排斥反应的防治措施。方法:1999-09-21南方医科大学南方医院为2例男性患者同时进行了右手异体移植,其一患者2年前炸鱼时将右手炸毁,初期手术作残端修整;其二患者2年前右腕部被钢丝勒断,在当地医院行再植术失败后作残端修整。2000-09-26又为一双前臂缺失患者进行了异体手移植,患者的双前臂炸伤缺失1年,缺失平面为右前臂中下1/3,左前臂中上1/3。3例患者心理及免疫状态均正常,无全身性疾病,残肢局部情况好,强烈要求手移植。以与受者ABO、Rh血型相同,HLA配型良好的脑死亡患者为供体;所有供肢尺桡骨骨髓刮除,其中2例供肢于移植前行8Gy的X射线照射;全部患者显微镜下吻合动脉、静脉及神经,联合应用免疫抑制剂;动态检测外周血T细胞亚群和细胞因子。结果:①患者手移植一般情况及移植手皮肤、组织病理检查结果:3例患者手移植后,生命体征平稳,移植术后手血运均良好,无合并细菌、病毒和真菌感染,皮肤愈合同断肢再植,移植手全部成活,临床症状、体征及皮肤病理检查均提示没有发生急性排斥反应。②外周血细胞因子动态检测提示:移植术后诱导期血清中白细胞介素2、肿瘤坏死因子α、干扰素-γ水平迅速下降,1周后恢复至手术前水平,随后逐渐降低并维持在低水平。结论:异体手移植急性排斥反应的预防与供受者间的组织配型、供肢的适当处理、免疫抑制剂应用的个体化、微创外科技术、周密的预防感染措施等因素密切相关。术后监测血清中白细胞介素2、肿瘤坏死因子α、干扰素-γ的水平可以早期判断排斥反应的发生。     

磁共振灌注成像监测组织工程骨血管化的研究

目的探讨磁共振灌注成像在组织工程骨血管化监测中的应用价值。方法成年恒河猴体内制备胫骨20mm的骨缺损，随机分为5组，A组：／β-磷酸三钙（β-TCP）＋骨髓基质干细胞（BMSCs）＋血管束；B组：β-TCP＋血管束；C组：β-TCP＋BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间（SI—T）曲线的最大线性斜率（SSmax）和基线值（SIbascline），拍摄恒河猴胫骨x线片并计算其透光度。结果术后4、8、12周A组的SSk值最高，术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高（P〈0．01）。术后12周A组5个样本的SSmax与X线片透光度呈负相关（r=-1．0，P〈0．01）。结论SI-T曲线的SSmax能准确反映组织工程骨的血管化情况，磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

体外培养的骨骼肌卫星细胞生长与分化特性的研究

目的探讨体外培养的骨骼肌卫星细胞的生长与分化特性.方法取大鼠肱三头肌,采用二步消化法分离骨骼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养.通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果二步消化法适用于大鼠骨骼肌卫星细胞的分离,在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管.骨骼肌特异性蛋白α-sarcometric actin和myosin免疫化学染色显示,骨骼肌卫星细胞弱阳性,肌管强阳性.结论体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的生长与分化能力,适用于骨骼肌组织工程的构建与研究.     

螺旋CT在肘关节周围复杂骨折诊断治疗中的应用

目的 探讨螺旋CT在肘关节周围复杂骨折诊断治疗中的意义,以提高肘部骨折的诊疗水平.方法 2005年1月至2007年5月,对32例有移位的肘关节周围骨折患者术前进行常规x线片、CT平扫及螺旋CT检查,明确骨折类型,然后制定于术方案和选择最佳的手术入路,术后随访并观察肘关节功能的康复情况.结果 32例肘关节周围骨折中,x线片可明确骨折诊断及分型者17例;CT平扫可明确骨折诊断及分型者30例;螺旋CT可明确诊断及分型者32例.通过螺旋CT对患者肘关节周围骨折明确的分型诊断,针对不同骨折类型,采用个性化手术治疗.32例患者术后随访6～24个月(平均15个月),术后患肘关节的活动范围较术前好,屈曲平均125°;伸直差值平均24.5°;旋前平均80°;前臂旋后平均75°.X线榆查骨折愈合好,无骨化性肌炎,无一例发生伤几感染、术后关节不稳和明显疼痛等并发症.依据Mayo肘火节功能评定标准:优21例,良7例,可4例,优良率为87.5%.结论 术前行螺旋CT能够在三维空间直观、清晰地显示出肘关节周围复杂骨折的全部细节.有助于确定骨折分型,有利于临床医生在术前选择适当、合理的治疗方案、手术入路和内固定方法,从而提高肘部复杂骨折的诊疗水平.