基于肝细胞线粒体功能探讨“化瘀祛痰、健脾化浊”法对动脉粥样硬化的治疗作用

“化瘀祛痰、健脾化浊”法是中医治疗高血脂症的常用方法。现代医学研究证实:高血脂症是导致动脉粥样硬化(AS)与非酒精性脂肪肝(NAFLD)的重要因素,而血脂代谢主要在肝脏内完成,其中线粒体在血脂代谢中起着重要的作用,而NAFLD能导致肝功能异常。AS主要表现为血瘀、痰浊内阻(标实)与脾虚、血气虚弱(本虚),而中医中的“脾”包括现代医学中的肝、胰、胃等脏器。“化瘀祛痰、健脾化浊”法能通过改善脾虚、痰浊血瘀而改善高血脂症与NAFLD,进而改善AS。笔者通过查阅近年来的相关文献并结合课题组近年来的研究结果,探讨以肝细胞线粒体为靶点,采用“化痰祛瘀、健脾化浊”法防治AS的作用,进而丰富中医藏象理论内涵,为防治AS提供新的思路。     

衰老模型小鼠心肌线粒体酶活性与茜草的影响

目的：探讨衰老小鼠心肌线粒体酶活性的变化及茜草的保护作用。方法：实验于2003-03／06在佳木斯大学医学院生化实验室完成。将36只昆明种小鼠随机分为对照组，衰老模型组和茜草组，每组12只．用D-半乳糖诱导衰老模型，30d后测定心肌线粒体超氧化物歧化酶，钠-钾-三磷酸腺苷酶和钙-三磷酸腺苷酶的活性。结果：衰老模型组超氧化物歧化酶，钠-钾-三磷酸腺苷酶和钙-三磷酸腺苷酶的活性均明显降低；茜草可升高衰老模型组超氧化物歧化酶，钠-钾-三磷酸腺苷酶和钙-三磷酸腺苷酶活性。结论：茜草对衰老模型小鼠心肌线粒体有保护作用，为中医药抗癌衰老研究提供实验依据。     

痿证中药方抑制线粒体内质网应激减轻大鼠脊髓损伤

目的研究痿证中药方对脊髓损伤(SCI)大鼠模型中氧化应激反应及内质网应激相关蛋白表达的调节作用。方法SPF级SD大鼠30只随机分为为假手术组、脊髓损伤模型组及痿证中药方组,痿证中药方组予以痿证中药方干预。术后第3~4天、1周、2周、3周、4周进行下肢运动功能评分,干预后30 d,取脊髓组织并采用HE染色法检测脊髓损伤情况,采用免疫组织化学法测定脊髓损伤大鼠内质网应激蛋白GRP78、ATF4和CHOP的含量,采用酶联免疫吸附试剂盒测定氧化应激指标MDA、CAT、SOD、GSH-Px的含量。结果术后SCI组大鼠出现了不同程度的后肢运动功能障碍,而Sham组各大鼠均未见明显运动功能损害(P<0.05)。HE染色可见Sham组中脊髓组织灰质及白质结构正常,神经元结构清晰,未见显著的脊髓受损。与Sham组比较,SCI组大鼠的脊髓组织中观察到脊髓结构严重受损,脊髓中央部的灰质和位于周围部的白质结构模糊,胞核皱缩或溶解消失并伴有不同程度的中性粒细胞浸润及大量小胶质细胞增生。治疗组脊髓结构比模型组明显改善,脊髓组织病变相对较轻,小区域的神经元坏死,少量的嗜酸性细胞增多,小胶质细胞浸润。免疫组织化学染色显示给予痿证中药方后GRP78、ATF4和CHOP的表达与SCI组相比明显减少(P<0.05),ELISA结果显示痿证中药方逆转MDA、CAT、SOD及GSH-Px活性的表达(P<0.05)。结论痿证中药方可以通过抑制线粒体损伤、减轻脊髓损伤情况、抑制氧化应激以及降低内质网应激相关蛋白的表达,从而促进脊髓损伤后大鼠运动功能的恢复。     

仙藕乳蒲方对糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合及线粒体的影响

[目的]探讨仙藕乳蒲方对糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合及线粒体的影响。[方法]将48只雄性SD大鼠通过灌胃高脂乳剂、注射链尿佐菌素(STZ)、制作背部全层皮肤溃疡制成糖尿病大鼠溃疡模型,随机分为模型对照组、仙藕乳蒲方组,仙藕乳蒲方组敷以仙藕乳蒲方粉末,模型对照组不予处理。造模后第3、7、14天大鼠观察后处死取材,透射电镜观察创面组织成纤维细胞线粒体超微结构,酶联免疫吸附测定(ELISA)各组创面三磷酸腺苷(ATP)、活性氧分子(ROS)含量并进行统计学分析。[结果]第7、14天仙藕乳蒲方组创面愈合率均高于模型对照组(P<0.05)。超微结构示仙藕乳蒲方组第3天线粒体肿胀程度较模型对照组轻,少数嵴消失。第7天线粒体肿胀轻度减轻,较多可见清楚嵴结构的线粒体。第14天线粒体数量丰富且结构清楚;而模型对照组第7天线粒体结构破坏更严重,伴聚集、变形、融合等改变。第14天肿胀线粒体数量减少,部分可见清楚嵴结构。ELISA结果,第7、14天,仙藕乳蒲方组ATP均高于模型对照组,ROS均低于模型对照组(P<0.05)。[结论]仙藕乳蒲方能防护线粒体损伤,促进线粒体生成ATP并抑制ROS过度产生,改善线粒体能量供应,降低创面氧化应激水平,进而促进糖尿病溃疡大鼠创面愈合。     

葱白提取物诱导PGC-1α活化非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体代谢的研究

[目的]探讨葱白提取物通过诱导过氧化物酶体增殖物受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)活化非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠线粒体代谢的机制。[方法]采用高脂饮食造模,将48只雄性大鼠随机分为空白组、模型组、葱白组、空转组、转染组、转染加葱白组,并运用小干扰RNA技术抑制PGC-1α的表达,实验检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测大鼠肝脏乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、肉毒碱棕榈酰基转移酶-1(CPT-1)mRNA的表达情况,观察肝脏组织病理改变,蛋白质印迹法(Western Blot)验证线粒体合成相关蛋白PGC-1α、核呼吸因子1(NRF-1)、线粒体转录因子A(TFAM)和线粒代谢相关蛋白细胞色素c氧化酶B(COX-B)、细胞色素c氧化酶合成蛋白(SCOX)、中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)的表达。[结果]与空白组相比,模型组大鼠肝脏出现明显脂肪变性;葱白提取物可降低TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平(P<0.01),同时ACCase mRNA表达水平降低(P<0.01),CPT-1 mRNA表达水平升高(P<0.01),缓解脂肪肝变性,并上调PGC-1α、NRF-1、TFAM、COX-B、SCOX、MCAD蛋白的表达(P<0.01)。同时,与模型组相比,在转染加葱白组的大鼠中上述检测指标,未见明显变化。[结论]PGC-1α是葱白提取物治疗NAFLD的重要靶点。葱白提取物可通过上调PGC-1α改善NAFLD模型大鼠线粒体功能,维持线粒体呼吸链稳定,从而起到活化线粒体代谢以及改善脂肪肝变性的效果。     

抗心肌线粒体自身抗体的识别及其临床意义

抗线粒体抗体在不同的炎症性心脏疾病患者血清中发现,且抗体识别的靶抗原各异。本文以猪心肌线粒体为抗原,应用点免疫-过氧化物酶抗过氧化物酶(DI-PAP)法和免疫转印技术(IBT),检测扩张型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌线粒体自身抗体,探讨该抗体识别的靶位和临床意义。     

Caspase非依赖性细胞程序性死亡

一直以来细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡。后者是一种程序化的主动性细胞死亡,caspase在其中起着决定性作用。但是凋亡并非细胞程序性死亡的唯一形式。大量研究结果表明还存在caspase非依赖性的细胞程序性死亡,已被人们初步认识的有自体吞噬作用、paraptosis以及与线粒体相关的途径。这些caspase非依赖性的细胞程序性死亡途径在清除机体有害细胞和成分上起着非常重要的作用,并与发育和许多生理/病理现象密切相关。     

川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤的作用机制研究

目的探究川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)的作用及机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组和川陈皮素(10 mg/kg)组,采用ELISA法检测各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性;采用苏木素-伊红(HE)染色法考察各组大鼠肝组织病理变化;采用透射电子显微镜(TEM)观察各组大鼠肝细胞线粒体结构;采用Western blotting和qRT-PCR考察各组大鼠肝组织自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、自噬相关基因-7 (autophagy-related gene-7,ATG-7)、p62蛋白和mRNA表达情况。采用H2O2诱导大鼠肝细胞BRL建立氧化损伤细胞模型,设置对照组、模型组和川陈皮素(10μmol/L)组,采用Western blotting和qRT-PCR考察各组细胞Beclinl、LC3-Ⅱ、ATG-7、p62蛋白和mRNA表达情况;采用MitoTracker染色和免疫荧光法考察各组细胞自噬蛋白与线粒体的共定位情况;考察自噬抑制剂和诱导剂对川陈皮素细胞保护作用的影响。结果与对照组比较,模型组大鼠血清ALT和AST活性均显著升高(P0.05),肝组织病变,肝细胞线粒体数目增加,结构错乱,受损的线粒体被吞噬,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05);与模型组比较,川陈皮素组大鼠血清ALT和AST活性明显降低(P0.05),肝组织病变程度减轻,线粒体形态变化得到明显改善,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclinl、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05)。氧化损伤细胞模型中BRL细胞LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目增加;与模型组比较,川陈皮素组BRL细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目减少;自噬抑制剂3-MA (1、5 mmol/L)显著增强川陈皮素对BRL细胞的保护作用(P0.05),自噬诱导剂雷帕霉素显著抑制川陈皮素对BRL细胞Beclin1蛋白和mRNA表达水平的下调作用(P0.05)。结论川陈皮素对HIRI具有较好的防治作用,其机制可能与抑制线粒体自噬有关。     

具有线粒体靶向性的雷公藤甲素TPP-PEG-PCL脂质体的制备及其促肝肿瘤细胞凋亡研究

目的 成功制备雷公藤甲素（3-丙羧基）三苯基溴化膦（TPP）-聚乙二醇-b-聚己内脂（PEG-PCL）脂质体（Tr@TPP/Lip）,评价其靶向性及促肝肿瘤细胞凋亡效果。方法 采用正交试验优选Tr@TPP/Lip的制备工艺,再研究该载药系统的粒径、Zeta电位、载药量、包封率和多分散系数及透射电镜微观形态,评价Tr@TPP/Lip的稳定性、溶血性、释放情况;采用荧光试验,研究脂质体与肝肿瘤细胞的融合情况、线粒体靶向性和肝脏靶向性;在等剂量给药条件下,评价Tr@TPP/Lip促肝癌细胞凋亡效果。结果 正交试验优选的Tr@TPP/Lip粒径为（113.5±17.6）nm,Zeta电位（12.6±0.7）mV,包封率为（71.3±3.2）%,载药量为（3.9±1.1）%,多分散系数为0.12±0.04;透射电子显微镜图片显示Tr@TPP/Lip呈规则圆球形,该脂质体稳定性良好,具有较小的溶血率和良好的缓释药物性能;荧光试验结果显示,TPP阳离子能促进脂质体与肿瘤细胞的融合,并靶向线粒体,还能提高药物在肝肿瘤部位的靶向和滞留效果;细胞药效结果显示,Tr@TPP/Lip具有良好的促肝肿瘤细胞凋亡效果,能明显降低线粒体膜Zeta电位、增加细胞内活性氧水平和Caspase-3的释放,显著增加促凋亡蛋白Bcl-2、减少抗凋亡Bax蛋白的表达,这些细胞凋亡试验结果均明显优于雷公藤甲素普通脂质体和雷公藤甲素。结论 Tr@TPP/Lip具有较好的线粒体靶向功能,能增强药物促肝肿瘤细胞凋亡效果。     

清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤线粒体融合蛋白2表达的影响

目的研究清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤后线粒体融合蛋白2表达的影响,探究清脑益元汤对缺血性脑损伤神经元保护作用的部分机制。方法将96只健康SD大鼠按随机数字表法分为4组:空白组(n=6)、假手术组(n=30)、模型组(n=30)、清脑益元汤组(n=30),除空白组外,假手术组、模型组及清脑益元组按缺血损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d五个取材时间点分为5个亚组。预给药7 d后,采用改良的Longa线栓法制备大鼠急性脑缺血损伤模型,造模成功后取大鼠缺血侧皮质区脑组织,采用免疫蛋白印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)法检测大鼠缺血侧皮质区Mfn2蛋白及mRNA表达。结果 (1)神经功能缺损评分:空白组和假手术组大鼠的神经功能评分为0分,两组比较差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,清脑益元组在各个时间点的神经功能缺损症状均有改善(P0.01);(2)Western blot法:空白组和假手术组Mfn2蛋白表达水平在同一时间点比较无明显差异(P0.05);与假手术组同一取材时间点相比,模型组Mfn2蛋白表达水平降低(P0.01);与模型组同一取材时间点比较,清脑益元汤组Mfn2蛋白表达水平显著上升(P0.01);(3)Real-Time PCR法:空白组和假手术组Mfn2mRNA表达水平在同一时间点比较无明显差异(P0.05);与假手术组同一取材时间点相比,模型组Mfn2mRNA表达水平显著降低(P0.01);与模型组同一取材时间点相比,清脑益元汤组Mfn2mRNA表达水平升高(P0.01)。结论清脑益元汤可通过上调脑缺血损伤后Mfn2表达,抑制线粒体损伤,减少神经细胞凋亡,进而发挥脑保护的作用。