中医临床研究过程质量控制评估指标的筛选及建立

目的建立中医临床研究过程质量控制评估指标,以实现对中医临床研究质量控制的量化评价。方法通过核心小组讨论、专家咨询法,同时结合实地检查发现的问题,在中期量化评估指标的基础上将指标体系扩充至21个,并依此指标体系进行数据采集。以所采集的数据为基础数据,根据专家主观权重意见结合数据特征,通过聚类分析、相关性分析等统计方法进一步筛选和优化指标,最后通过因子分析方法验证最终筛选指标理论层次构建的合理性及评估指标的可应用性。结果确定了14个量化评估指标进行质控量化评价。结论确定的评估指标在主观认识与数理依据之间基本一致,依此对中医临床研究进行质控评估是可行的。     

金芪降糖片组分体外抗糖尿病的作用及机制

目的:探讨金芪降糖片各组分体外抗糖尿病的作用及机制。方法:采用DPPH自由基清除,活性氧自由基清除,AGEs形成抑制,α-糖苷酶抑制,醛糖还原酶抑制,脂肪酶抑制,脂多糖(LPS)诱发小鼠腹腔巨噬细胞活化一氧化氮(NO)释放抑制建立系统的体外抗糖尿病活性评价筛选模型,考察金芪降糖片的4个标准组分芪总黄酮、黄芪总皂苷、金银花总有机酸、黄连总生物碱对以上各模型的作用。结果:黄芪总黄酮、金银花总有机酸、黄连总生物碱具有清除DPPH自由基和活性氧自由基活性;各组分对AGEs形成无明显抑制活性;黄芪总黄酮、金银花总有机酸对糖苷酶有抑制活性;黄芪总黄酮、黄芪总皂苷、金银花总有机酸对醛糖还原酶有抑制活性;黄芪总黄酮、黄芪总皂苷、金银花总有机酸对胰脂肪酶具有抑制活性;黄芪总皂苷、黄连总生物碱对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放NO有抑制作用。结论:金芪降糖片具有多组分多靶点协同抗糖尿病的作用,机制涉及抑制α-糖苷酶、抑制脂肪酶、清除自由基、抑制醛糖还原酶、抑制NO释放。     

传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选

目的:运用计算机虚拟筛选技术从传统中药数据库(TCM database@Taiwan)中快速搜索H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的中药小分子抑制剂。方法:采用Auto Dock Vina软件对蛋白质晶体结构数据库PDB中NA与小分子抑制剂扎那米韦形成的复合物(PDB代码为4MWX)三维结构活性部位进行分析,基于传统中药配体库进行分子对接初次筛选。综合运用传统中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP及Accelrys公司开发的Discovery Studio 2.5分子模拟软件包内TOPKAT模块计算药代动力学参数和毒性预测对分子对接结果进行2次筛选。结果:以原配体(扎那米韦)的自由结合能为阈值,筛选出中国传统中药数据库中3个类药性良好的化学成分与NA亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦的天然小分子化合物,并且确定了它们的中草药来源。结论:该研究结果可促进从传统中药库中提取、设计及实验合成新抗H7N9流感病毒药物。     

中文版筛选型老年听力障碍量表在老年性聋中的应用

目的探讨中文版筛选型老年听力障碍量表(HHIE-S)在老年性聋中的应用价值。方法对入选的170名非独居老年人及其亲属发放自评和代理者HHIE-S量表,并测其纯音听阈,分析量表得分与听阈之间的相关性。结果两份量表得分与纯音听阈间均呈正相关性。以25d B作为听力下降标准,HHIE-S量表对老年聋的特异性值为95.24%,对老年性聋的敏感性为59.06%,并随着听力损失级别的提高,量表的敏感性增加。共有149人(占总数87.65%)通过测听表明有不同程度的听力损失,轻至中度聋的患者中有50人得分>8,提示有听力障碍,10-22分的有39人,提示为轻至中度聋,有11人得分在24-40分之间,提示为重度听力障碍;听阈为重度聋及以上的患者共有38人得分>8,提示有听力障碍,10-22分的有9人,提示为轻至中度聋,29人得分在24-40分之间,提示为重度听力障碍。结论中文版HHIE-S量表在老年性聋筛查中表现出较好的敏感性和特异性,与纯音测听具有较强相关性,可以用于老年性聋的早期筛查,有利于推动老年性聋患者早期积极治疗和康复。     

云南省恶性疟原虫对氯喹抗性的变化

目的了解云南恶性疟原虫对氯喹抗性的变化. 方法从1981年起,在滇西、滇南、滇东南监测点选择符合条件的恶性疟病人,取静脉血,采用WHO推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性,并将相隔8～10年的测定结果进行比较. 结果滇西恶性疟原虫对氯喹抗性率从1982年的100%下降到2003年的83.3%,ID50 从240.0 nmol/L降到123.0 nmol/L,MIC从1 171.6 nmol/L降至325.9 nmol/L,分别下降13.0%、48.8%和72.2%.滇南恶性疟原虫对氯喹抗性率从1981年的97.4%降到2004年的69.0%,ID50从170.0 nmol/L降至58.6 nmol/L,MIC从1 108.0 nmol/L降至312.6 nmol/L,分别下降29.1%、65.5%和71.8%;滇东南抗性率从1993年的78.9%下降至2003年的53.3%,ID50从136.0 nmol/L降至75.5 nmol/L,MIC从452.0 nmol/L 降至238.3 nmol/L,分别下降32.4%、44.5%和47.3%. 结论云南恶性疟原虫对氯喹仍具有抗性,但抗性程度明显下降;中越边境恶性疟的抗性程度低于中老、中缅边境地区.目前仍不宜用氯喹治疗当地恶性疟.     

Rapd screening mitochondrial DNA mutation by using denaturing high—performance liquid chromatography

AIM: To optimize conditions of DHPLC and analyze the effectiveness of various DNA polymerases on DHPLC resolution, and evaluate the sensitivity of DHPLC in the mutation screening of mitochondrial DNA (mtDNA). METHODS: Two fragments of 16s gene of mitochondrial DNA (one of them F2 is a mutant fragment) and an A3243G mutated fragment were used to analyze the UV detection limit and determine the minimum percentage of mutant PCR products for DHPLC and evaluate effects of DNA polymerases on resolution of DHPLC. Under the optimal conditions, we analyzed the mtDNA mutations from muscle tissues of mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS) and screened blindly for variances in D-loop region of mtDNA from human gastric tumor specimen. RESULTS:Ten A3243G variants were detected in 12 cases of MELAS, no alterations were detected in controls and these results were consistent with the results obtained by analysis of RFLP with ApaI. We also identified 26 D-loop variances in 46 cases of human gastric cancer tissues and 38 alterations in 13 gastric cancer cell lines. The mutation of mtDNA at 80 ng PCR products containing a minimum of 5% mutant sequences could be detected by using DHPLC with UV detector. Moreover, Ampli-Taq Gold polymerase was equally as good as the proofreading DNA polymerase (e.g., Pfu) in eliminating the false positive produced by Taq DNA polymerases. CONCLUSION: DHPLC is a powerful, rapid and sensitive mutation screening method for mtDNA. Proofreading DNA polymerase is more suitable for DHPLC analysis than Taq polymerase.     

甲状腺髓样癌人源噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）人源噬菌体单链抗体（single chain variable fragments,scFv）库中筛选出特异的抗MTC单链抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：分别以甲状腺上皮细胞TEC细胞株和MTC细胞TT细胞株为抗原进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集循环,筛选出抗MTC抗体,将筛选出的阳性克隆感染E.coli HB2151;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导抗体可溶性表达,HiTrapTM Anti E-tag柱纯化表达抗体;SDS-PAGE和Western blot检测抗体表达和相对分子质量;ELISA检测可溶性scFv的特异性和免疫活性,分为TT细胞组、SW480细胞组、TEC细胞组和PBS空白对照组,分别检测各组在酶标仪A450 nm处的吸光度;四甲基偶氮唑盐比色分析法（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）分别检测TT细胞组、SW 480细胞组与不同浓度svFv反应并读取A490 nm处的吸光度,设置空白对照PBS组,分别计算细胞抑制率。结果：5轮筛选后,抗体得到了明显富集。随机挑取单个细菌克隆,phage ELISA 和scFv ELISA阳性率分别为65%和50%。SDS-PAGE、Western blot结果显示MTC特异性抗体分子量为28 kD左右。ELISA结果显示,TT细胞组的吸光度（0.41±0.12）较SW 480细胞组（0.20±0.03）、TEC细胞组（0.13±0.01）、PBS空白对照组（0.07±0.01）明显增加（P=0.000）。MTT法结果显示,TT细胞组和SW 480细胞组在scFv浓度为0.1、1、10 μmol/L时,2细胞株间抑制率有统计学意义,统计量分别是t=2.881,P=0.02;t=5.073,P=0.006;t=7.324,P=0.000,且在scFv浓度为10 μmol /L时,对TT细胞的抑制率最高（0.59±0.15）％。结论：利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性的抗MTC人源单链抗体。     

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平糖舒目散治疗糖尿病的作用机制初探

目的:通过醛糖还原酶高通量模型对中药方剂平糖舒目散的筛选,探寻其治疗糖尿病的作用机制。方法:用高通量醛糖还原酶筛模型来筛选平糖舒目散,研究方剂平糖舒目散对醛糖还原酶的抑制作用。结果:平糖舒目散对醛糖还原酶有较强的抑制作用,其半数抑制浓度是0.8 g/L。结论:中药方剂平糖舒目散治疗糖尿病慢性并发症的作用机制之一是抑制醛糖还原酶活性。