幽门螺杆菌cheA基因在细菌体外趋化和体内定植过程中的作用

目的 了解cheA基因在幽门螺杆菌体外趋化和体内定植中的作用.方法 从幽门螺杆菌NCTC11637株基因组DNA中扩增并克隆全长cheA和cheY基因.构建该两个基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取目的 重组蛋白rCheA和rCheY.rCheA和rCheY免疫家兔制备抗血清,采用硫酸铵沉淀法及DEAE-52柱层析法制备rCheA-IgG和rCheY-IgG.构建cheA基因自杀质粒,根据同源重组交换原理利用该自杀质粒构建cheA基因敲除突变株(cheA-),采用PCR及测序对cheA-突变株进行鉴定.采用rcheA-IgG和rCheY-IgG锚定靶蛋白及蛋白磷酸化检测试剂盒,测定cheA-突变株与野生株CheA和CheY分子磷酸化水平.采用幽门螺杆菌趋化模型及BALB/c小鼠感染模型,比较cheA-突变株与野生株体外趋化及体内定植能力的差异.结果 PCR及测序结果证实cheA-突变株基因组中cheA基因被敲除.0.001～0.1 mol/L盐酸作用10 min,野生株CheA和CheY磷酸化水平分别从(59.6±11.5)和(55.5±10.2)μmol迅速下降至(10.8±2.6)和(5.5±1.2)μmol(P＜0.05),cheA-突变株CheY磷酸化水平均较低且无明显变化(P＞0.05).cheA-突变株对盐酸、硫酸和乙酸趋化聚集环直径[(10～20)±(2～3)mm]明显小于野生株[(16～24)±(2～3)mm],P＜0,05.野生株感染小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率(90%)明显高于cheA-突变株(40%),P＜0.05;荧光定量PCR结果也显示野生株感染小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌数量(6.3×103±2.1×103拷贝/mg)也明显高于突变株的(8.3×101±3.1 ×101拷贝/mg),P＜0.05.结论 cheA基因在幽门螺杆菌体外趋化和体内定植中有促进作用.     

钩端螺旋体脂多糖诱导J774A.1细胞凋亡及相关信号通路调控作用的研究

目的 了解问号钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)体外诱导小鼠单核-巨噬样细胞株(J774A.1)凋亡及Toll样受体(TLR)和相关信号通路调控细胞凋亡的作用.方法 酚水法从问号钩体黄疸出血群赖型赖株中提取L-LPS.流式细胞术测定L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡及FasL中和抗体阻断细胞凋亡的作用.实时荧光定量RT-PCR(qPCR)及流式细胞术检测L-LPS作用前后J774A.1细胞Fas/FasLmRNAs和蛋白表达水平变化.TLR2或TLR4抗体封闭试验、信号通路阻断试验及流式细胞术,检测TLR2、TLR4及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和胞外信号调节激酶(ERK)通路对L-LPS诱导细胞凋亡的调控作用.结果 100 ng/ml L-LPS作用J774A.1细胞4、12和24 h的凋亡率分别为56.50%、69.28%和24.35%,FasL中和抗体封闭后,细胞凋亡率分别下降至11.21%、21.58%和12.70%(P＜0.05).L-LPS作用4、12和24 h的J774A.1细胞FasL和Fas mRNAs水平分别为正常细胞的1.34、2.12、2.10及2.45、3.87、3.12倍(P＜0.05),FasL和Fas蛋白表达率分别从L-LPS作用前的4.82%和15.32%上调至18.61%、60.13%、42.75%(P＜0.05)和76.34%、85.70%和77.92%(P＜0.05).TLR2抗体封闭后L-LPS诱导J774A.1细胞的凋亡率(11.54%)明显低于未封闭细胞(66.56%,P＜0.05),但TLR4抗体封闭细胞的凋亡率仍高达55.27%(P＞0.05).p38MAPK与JNK通路阻断后L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡率(20.54%和47.98%)明显低于未阻断细胞(62.17%,P＜0.05),ERK通路阻断后细胞凋亡率仍高达61.72%(P＞0.05).结论 L-LPS经TLR2识别后通过p38MAPK和JNK通路上调J774A.1细胞Fas和FasL表达,从而参与L-LPS诱导细胞凋亡过程.     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对小鼠单核巨噬细胞产NO及其合酶的影响

目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)对小鼠单核-巨噬细胞(J774A.1)产生一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法 应用MTT法检测rVvhA对J774A.1增殖的抑制作用;Griess法检测NO含量;RT-PCR和免疫荧光法检测iNOS mRNA和蛋白表达水平.结果 0.8 HU/ml及以上浓度rVvhA可显著抑制J774A.1的增殖;在IFN-γ的辅助作用下,0.4 HU/ml的rVvhA即可诱导J774A.1产生大量NO,显著增加细胞内活性以及iNOS mRNA和蛋白表达水平.结论 rVvhA可诱导巨噬细胞产生NO和iNOS表达,在创伤弧菌的致病机制中具有重要意义.     

幽门螺杆菌黏附素A有效T和B联合抗原表位噬菌体展示和抗原性测定

目的 分析并确定幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)分子中有效T细胞和B细胞联合(T/B)抗原表位.方法 重组表达HpaA(rHpaA)并免疫家兔制备抗血清.采用生物信息学技术预测和分析HpaA分子中T细胞和B细胞表位,PCB扩增T/B联合表位肽片段并构建其噬菌体展示系统.采用PEG/NaCl沉淀法提纯展示了T/B联合表位的重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化幽门螺杆菌全菌IgG抗体和rHpaA抗血清为一抗,采用Western blot和ELISA对rPⅢ蛋白中展示的T/B联合表位进行筛选和鉴定.采用MTT检测rHpaA免疫小鼠脾细胞在不同重组噬菌体蛋白刺激下的增殖情况.结果 HpaA分子中共有5个T/B联合表位:HpaA10、HpaA37、HpaA79、HpaA116和HpaA143.所有T/B联合表位均成功地展示于M13噬菌体PⅢ蛋白表面.Western blot、ELISA和淋巴细胞增殖试验结果 均显示,HpaA116是优势抗原表位,HpaA37和HpaA79为有效抗原表位,HpaA10和HpaA143为无效抗原表位.结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌HpaA的T/B联合表位肽噬菌体展示系统.HpaA37和HpaA79,尤其是HpaA116是HpaA有效T/B联合抗原表位.     

rVvhA诱导小鼠单核巨噬细胞凋亡的作用及其机制

目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡的作用及机制.方法 MTT法、电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、线粒体膜电位和cagpase活性检测等方法测定rVvhA诱导J774A.1凋亡的作用.结果 MTT结果显示rVvhA能够抑制J774A.1生长.2.0溶血单位(HU)/ml和3.0 HU/ml的rVvhA作用J774A.18 h后,透射电镜观察细胞和线粒体形态发生凋亡改变;流式细胞仪检测凋亡率分别为(7.80±0.62)%、(12.33±0.12)%,均高于正常组(3.07±0.67)%;线粒体膜电位也下降,流式细胞仪结果显示绿色荧光率分别是9.8%、39.2%.其中3.0 HU/ml rVvhA作用组,caspage-3、9活性增加,并且具有时间依赖性,而cagpage-8活性没有明显改变.3.0HU/ml rVvhA加caspage-3抑制剂(Ac-DEVD-FMK)或caspase-9抑制剂(Ac-LEHD-FMK)的凋亡率与3.0 HU/ml rVvhA作用组相比都降低,分别为(6.23±3.95)%、(9.60±3.14)%;同时cagpage-3、9活性也下降.结论 rVvhA具有诱导J774A.1凋亡的生物学活性;其机制可能与依赖cagpase的线粒体途径有关.     

急性脑出血患者糖代谢变化分析

目的观察急性脑出血患者的糖代谢变化情况。方法选择我院2006年1月～2009年11月收治的557例急性脑出血住院患者,采集一般资料、病史及临床表现。有糖尿病史者入院后测空腹血糖和餐后2 h血糖（2-hPG）;无糖尿病史者于发病1周病情稳定后行标准75 g葡萄糖耐量试验（OGTT）,以判断糖代谢情况。结果 557例脑出血中正常糖耐量189例（33.90%）,糖代谢异常368例（66.1%）,其中糖尿病185例（33.2%）,糖调节受损183例（32.9%）。不行OGTT仅依据空腹血糖检测则有89.1%（163/183）的糖调节受损和14.1%的（26/185）糖尿病被漏诊。结论脑出血患者大多合并糖代谢异常,通过OGTT可及时发现,有利于制订合理的治疗方案,提高生存率,改善预后。     

头、体针联合应用分期治疗脑卒中患者下肢功能障碍

目的:验证头、体针联合应用分期治疗对脑卒中患者下肢功能恢复的疗效。方法:96例患者随机分为观察组和对照组,每组48例。两组均接受常规药物、康复治疗,观察组采用头、体针联合应用分期针刺,软瘫期穴取伏兔、血海、足三里等,痉挛期穴取环跳、血海、阳陵泉等,配合头针取病灶侧顶颞前斜线(即运动区);对照组不分期选穴、不用头针,按照"醒脑开窍"针刺法和"治痿独取阳明"针刺治疗,均连续治疗8周。采用改良的Fugl-Meyer运动功能评分法(FMA)及Bar-thel指数(BI)对两组患者治疗前后的下肢运动功能及日常活动能力进行评定。结果:两组患者治疗后FMA、BI评分均有明显提高(均P<0.05),且治疗后观察组的FMA、BI评分均高于对照组(均P<0.05);治疗8周后观察组能步行的比率高于对照组[56.3%(27/48)vs 35.4%(17/48),P<0.05],且步速快于对照组(P<0.05)。结论:头、体针联合应用分期治疗脑卒中可明显改善患者的下肢运动功能和日常生活能力,尽快恢复患者步行能力和步速,且优于常规针刺。     

比较牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β能力及相关信号通路受体的差异

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS)诱导人单核巨噬细胞株THP-1和人粒细胞白血病细胞株HL-60分泌白介素-1β(interleukin,IL-1β)能力差异,并了解其相关Toll样受体.方法 采用酚水法提取牙龈卟啉单胞菌ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS).采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β水平.采用TLR2或TLR4抗体阻断试验联合ELISA检测.了解Pg LPS结合不同靶细胞上Toll样受体的类型.实验中采用大肠杆菌脂多糖(E-LPS)作为Pg-LPS对照.结果 1μg/ml Pg-LPS作用6 h或1μg/ml E-LPS作用24h,THP-1细胞分泌的IL-1β水平明显升高(P<0.01).但Pg-LPS和E-LPS诱生的细胞因子最高浓度相近(P>0.05).而1μg/ml Pg-LPS作用24h或1μg/ml E-LPS分别作用48h,HL-60细胞分泌的IL-1β水平明显升高(P<0.01),且Pg-LPS诱生的最高浓度明显高于E-LPS(P<0.05),但HL-60细胞分泌的上述胞因子最高浓度均明显低于THP-1细胞(P<0.01);TLR2和TLR4抗体均可有效阻断Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-1β的活性(P<0.05),但仅发现TLR2抗体可阻断Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β的活性(P<0.05).E-LPS诱导THP-1细胞或HL-60细胞分泌IL-1β的活性仅可被TLR4抗体所阻断(P<0.05).结论 Pg-LPS诱导THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β高于E-LPS.TLR2和/或TLR4作为Pg-LPS受体取决于细胞种类.     

基于淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA-pIB融合基因重组产物酶联免疫吸附试验的建立和应用

2005年6月天津市武清区汊沽港镇发生以发热、腹泻、恶心、呕吐和脓血便为主要症状的病例,共确诊患者1189例,经流行病学调查确认是一起由于生活饮用水源污染而导致的福氏志贺痢疾杆菌3a型细菌性痢疾(菌痢)的暴发.