雌激素受体对乳腺癌细胞截短型神经激肽受体-1 的调控作用

摘要： 目的 探讨雌激素受体 α （ERα） 阳性的乳腺癌细胞中 ERα 对神经激肽受体-1 截短型变异体 （NK1R-Tr）的调控作用, 以及 ERα 是否通过调控 NK1R-Tr 的表达, 间接调控细胞的增殖能力。方法 染色质免疫共沉淀（CHIP） 实验验证 ERα 是否可以结合到 NK1R-Tr 启动子上游的 ERα 反应元件, 直接调控 NK1R-Tr 的表达; 荧光素酶报告基因实验验证 ERα 是否对 NK1R-Tr 的表达起正性调控作用。Western blot 实验和 RT-PCR 实验检测乳腺癌细胞系 MCF-7 和 T47D 的 ERα 和 NK1R-Tr 在蛋白水平和 mRNA 水平的表达情况; 以及在 ERα 激动剂雌二醇 （E2）刺激的条件下, 小干扰 RNA 敲除 ERα 后, NK1R-Tr 在不同水平的表达情况; 小干扰 RNA 敲除 NK1R-Tr 后, CCK-8 和克隆形成实验检测敲除 NK1R-Tr 的乳腺癌细胞的增殖能力。结果 在 NK1R-Tr 基因启动子上游存在 ERα 的反应元件, ERα 在 E2 存在条件下作用于该反应元件, 对 NK1R-Tr 的表达起正性调控作用。同样在 E2 刺激的条件下,敲除乳腺癌细胞 MCF-7 内源性 ERα 后, NK1R-Tr 在蛋白水平和 mRNA 水平的表达均下降; 且敲除 NK1R-Tr 的 MCF-7 细胞增殖能力较未敲除组明显降低。结论 在 ERα 阳性的乳腺癌细胞中, ERα 正性调控 NK1R-Tr 的表达,从而增强细胞的增殖能力。     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。     

H1299细胞中P1k3对p73转录活性的影响

背景与目的:研究表明蛋白激酶P1k3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶P1k3对p73转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶P1k3及激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73转录活性的影响.结果:荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达(P<0.05);共转染p73基因和P1k3基因,p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3(K52R)对p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果也显示,p73诱导p2~(WAF1)和Bax的mRNA表达(P<0.05),P1k3降低了p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平(P<0.05);而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05).克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成(P<0.05),P1k3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制(P<0.05),而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响(P>0.05).结论:P1k3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73的转录活性无明显影响.     

LUNX基因增强子的克隆及调控活性分析

目的 鉴定人肺特异性X蛋白(lungspecific X protein,LUNX)基因的增强子及其调控活性.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增生物信息学预测的3个增强子片段(E1:+3770～+3959bp;E2:+6454～+6555bp;E3:+14553～+14652bp),通过荧光素酶报告基因表达体系检测转录活性.结果 PCR产物经测序证实后,分别定向连接至pGL3-Promoter载体中报告基因启动子上游的KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点和报告基因下游的BamHI和SalⅠ酶切位点上,经酶切鉴定后,构建了6种荧光素酶报告基因表达体系.以pSV-β-Galactosidase质粒为内对照,瞬时转染HEK293细胞,培养48h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性.当3个DNA片段位于报告基因启动子上游时,均不具有增强转录的能力.将它们分别连接于报告基因下游时,E1和E3所调控的荧光索酶活性分别是对照pGL3-Promoter的2.83倍(P<0.05)和1.59倍(p<0.05).结论 LUNX基因的+3770～+3959bp和+14553～+14652bp序列具有增强转录的能力,为LUNX表达调控机制的深入研究奠定了基础.     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-α mRNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-α mRNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

Luciferase Assay to Screen Tumour-specific Promoters in Lung Cancer

Objective: Specific promoters could improve efficiency and ensure the safety of gene therapy. The aim ofour study was to screen examples for lung cancer. Methods: The firefly luciferase gene was used as a reporter,and promoters based on serum markers of lung cancer were cloned. The activity and specificity of sevenpromoters, comprising CEACAM5 (carcinoembryonic antigen, CEA), GRP (Gastrin-Releasing Peptide), KRT19(cytokeratin 19, KRT), SFTPB (surfactant protein B, SP-B), SERPINB3 (Squamous Cell Carcinoma Antigen,SCCA), SELP (Selectin P, Granule Membrane Protein 140kDa, Antigen CD62, GMP) and DKK1 (Dickkopf-1)promoters were compared in lung cancer cells to obtain cancer-specific examples with strong activity. Results:The CEACAM5, DKK1, GRP, SELP, KRT19, SERPINB3 and SFTPB promoters were cloned. Furthermore,we successfully constructed recombinant vector pGL-CEACAM5 (DKK1, GRP, SELP, KRT19, SERPINB3and SFTPB) contained the target gene. After cells were transfectedwith recombinant plasmids, we found thatthe order of promoter activity from high to low was SERPINB3, DKK1, SFTPB, KRT19, CEACAM5, SELPand GRP and the order for promoters regarding specificity and high potential were SERPINB3, DKK1, SELP,SFTPB, CEACAM5, KRT19 and GRP. Conclusion: The approach adopted is feasible to screen for new tumourspecific promoters with biomarkers. In addition, the screened lung-specific promoters might have potential foruse in lung cancer targeted gene therapy research.     

Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49细胞后荧光表达特性

目的利用生物发光成像技术对Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49膀胱癌细胞后双荧光表达量变化特性进行研究。方法用pAAV2neo-Gluc和pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc分别转染MB49细胞,利用荧光照度计来研究双荧光素酶质粒中Gluc、Fluc的特性;利用体外活体成像系统对双荧光素酶质粒Gluc-Fluc转染MB49膀胱癌细胞后荧光表达情况的检测。结果荧光照度计检测结果显示:Gluc随着细胞数的增多或时间的延长,荧光表达量呈相应的增加。Fluc随细胞数目的增多,荧光表达量增加;但随时间的延长,荧光表达量变化不大。体外活体成像结果显示:Gluc-Fluc双荧光素酶质粒已转染入MB49膀胱癌细胞,经过G418加压筛选获得稳定表达的细胞株。结论双荧光素酶基因的构建并未改变Gluc的自身荧光表达特性。转染双荧光素酶质粒的MB49膀胱癌细胞,由于其Fluc在活体成像时的定位优势和Gluc易分泌、检测灵敏度高的定量优势,为后期动态检测肿瘤生长变化以及评价药物治疗效果提供了一个可靠的基石和平台。     

影响启动子活性测定的关键影响因素

目的探讨载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系以及检测仪器等因素对启动子分析实验的影响。方法采用化学发光法测定荧光素酶,EGFP荧光强度采用流式细胞仪。以上检测每组样品均设三复孔,并重复两次,所得结果进行t检验。结果选择不同的报告基因、载体、质粒转染剂量、启动子长度和细胞系得到不同的结果。结论载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系的选择会对启动子分析的结果造成很大的影响,因此,在进行启动子分析前,应综合考虑上述因素,以达到更好的实验效果。     

人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。