绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。     

携硒、锌、维生素E大豆磷脂脂质体对大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的:观察对生物膜具有保护作用的携硒、锌、维生素E大豆磷脂脂质体对实验性大鼠心肌缺血损伤的影响。方法:实验于2002-06/2003-09在武汉大学医学院病理生理实验室完成。实验大鼠40只,单纯心肌缺血组10只、大豆磷脂脂质体保护组10只、携硒和锌及维生素E的大豆磷脂脂质体保护组10只,皮下注射异丙基肾上腺素30mg/kg,连续3d,制成心肌缺血模型;正常对照组10只不造模,注射等量的生理盐水。造模前大豆磷脂脂质体保护组灌服大豆磷脂脂质体(150mg/kg),携硒和锌及维生素E的大豆磷脂脂质体保护组大鼠灌服携硒、锌、维生素E的大豆磷脂脂质体20d,灌胃量为10μL/g,正常对照组、单纯心肌缺血组则灌服等量的生理盐水。检测大鼠血浆磷酸肌酸激酶活性采用生化法,检测心肌细胞凋亡率应用脱氧核糖核苷末端转移酶标记法,检测细胞凋亡相关基因Bcl-2及Bax表达应用免疫组织化学法。结果:进入结果分析实验大鼠40只。①血浆磷酸肌酸激酶活性:单纯心肌缺血组比正常对照组显著增强犤(4.4±0.8),(2.2±0.4)μkat/L,P<0.01犦。大豆磷脂脂质体保护组较单纯心肌缺血组明显降低犤(3.2±1.3)μkat/L,P<0.01犦,而携硒和锌及维生素E的大豆磷脂脂质体保护组也较单纯心肌缺血组显著降低犤(2.4±0.5)μkat/L,P<0.01犦,但两处理组之间无差异。②心肌细胞凋亡率:单纯心肌缺血组明显高于正常对照组犤(31.81±5.63)%,(3.59±1.35)%,P<0.01犦,大豆磷脂脂质体保护组及携硒和锌及维生素E的大豆磷脂脂质体保护组明显低于单纯心肌缺血组犤(19.91±4.03)%,(13.33±2.79)%,P<0.01犦,且后者减少缺血心肌细胞凋亡的效应明显高于单纯大豆磷脂脂质体处理组(P<0.05)。③心肌组织Bcl-2及Bax表达(吸光度值)的比较:单纯心肌缺血组均比正常对照组表达明显增多(0.302±0.017和0.281±0.011,0.304±0.013和0.253±0.011,P<0.01或0.05);大豆磷脂脂质体保护组较单纯心肌缺血组Bax蛋白表达明显减少(0.286±0.010,P<0.01),Bcl-2蛋白表达则明显增多(0.319±0.017,P<0.01);携硒和锌及维生素E的大豆磷脂脂质体保护组较大豆磷脂脂质体保护组Bcl-2蛋白表达明显增多(0.321±0.018,P<0.01),Bax表达明显减少(0.263±0.009,P<0.01)。结论:口服携硒、锌、维生素E大豆磷脂脂质体可通过保护细胞生物膜的作用,抑制心肌细胞凋亡而发挥保护心肌缺血损伤的效应。     

多种封边法在免疫组化染色中应用的比较

目前应用的免疫组化方法很多,在染色过程中应用其中任何一种方法,都要反复洗涤及用滤纸擦干组织周围的水分。在用滤纸擦片时,易造成玻片的折断将组织片擦掉,操作步骤烦琐,而且时常在片子留下纸屑,易污染组织切片,影响结果。进口油笔虽可代替,但费用昂贵。为了避免用滤纸擦片造成的副作用,使抗体浓度不被稀释及液体外溢等问题[1],本文对3种不同的封边方法进行了比较,从中筛选出一种较好的封边方法。现介绍如下。1材料与方法1·1材料医检标本或实验动物标本,进口油笔、小镊子一把、酒精灯一台、石蜡一小块、无色透明非珠光的指甲油一小瓶。1·…     

民航飞行学员扩张型心肌病一例

一、临床资料 患者,男性,25岁,民航飞行学员。2012年8月,航校毕业入职体检时心脏超声示：左室扩大,左室室壁运动异常,左室射血分数51％。后在北京军区总医院行心脏形态MR检查示：左室心腔扩大,心肌变薄且不均匀,室壁运动减弱,考虑扩张型心肌病。经心内科会诊后,诊断为扩张型心肌病。     

富蕴县半定居家庭牧场草畜平衡优化模式综合效益评价

选择具有典型代表性的半定居牧民家庭6户,并对其承包的天然草地、以及草畜平衡现状、畜牧业生产等方面进行本底调查,在此基础上制定了半定居牧民家庭牧场草畜平衡优化模式.根据研究,半定居家庭牧场暖季放牧7个月,冷季舍饲5个月是最优化方案.并对草畜平衡优化模式结果进行综合效益分析,家庭牧场年收入由现状年的39.42万元提高到调整年的63.41万元,增加23.99万元;支出费用由现状年的6.57万元增加到18.50万元,增加了11.93万元;年净收入由现状年的32.86万元增加到调整年的44.91万元,增加12.05万元;劳均净收入由现状年的2.88万元增加到调整年4.28万元,增加1.40万元.同时,草地产草量增加,毒害草及虫鼠害减少,草地退化、沙化、盐碱化得到控制.     

宁神健脾汤结合睡眠卫生宣教对心脾两虚型亚健康失眠的干预作用

目的:探讨宁神健脾汤结合睡眠卫生宣教对心脾两虚型亚健康失眠的干预作用.方法:150例心脾两虚型亚健康眠患者随机分成3组.治疗Ⅰ组50例,采用宁神健脾汤治疗;治疗Ⅱ组50例,采用单纯睡眠卫生宣教;治疗Ⅲ组50例,采用宁神健脾汤结合睡眠卫生宣教治疗.三组均以1周为1个疗程,共治疗4个疗程,各组分别于治疗前后采用匹兹堡睡眠质量指数(PSGI)、临床医生总体印象(CGI)、WHO生活质量测定量表简明版(HOQOL-BREFW)进行评分,并检测患者血清B、T4含量.结果:治疗Ⅲ组治疗第1、2、3、4周及治疗结束后2周PSGI、HOQOL-BREFW评分分别与治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);治疗Ⅲ组治疗第3、4周及治疗结束后2周CGI评分分别与治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);治疗Ⅲ组治疗第4周血清T3、T4含量分别与治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:宁神健脾汤结合睡眠卫生宣教对心脾两虚型亚健康失眠的干预具有显著作用.     

六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤肝癌细胞的增效作用

目的:探讨六味地黄丸主要入血成分对单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统杀伤大鼠肝癌细胞(CBRH7919)的增效作用.方法:按CBRH7919/tk占总细胞数10％的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,分别接种96孔板,每孔加细胞悬液100 μL(2×103个/孔),设置对照组、低、中、高3种浓度的六味地黄丸入血成分组、GCV组、各浓度六味地黄丸入血成分联合GCV组;培养24h后分别加入入血成分马钱素和丹皮酚(质量浓度均为25,50,100 μmol·L-1),莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸、獐牙菜苷(浓度均为37.5,75,150 μmol·L-1)5种化合物和5种化合物混合组分(质量浓度为0.0067,0.0135,0.027 g·L-1);及其混合组分(质量浓度为0.034 g·L-1)作用后淋巴细胞培养上清(占培养液体积分数7.5％,15％,30％),设6个复孔,37℃,5％ CO2培养箱培养72 h后MTT法测定细胞存活率,检测六味地黄丸主要入血成分及淋巴细胞培养上清对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的影响.结果:自杀基因系统联合马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸、獐牙菜苷和丹皮酚5种化合物及5种化合物的混合组分,均未显示其对肿瘤自杀基因疗法的直接增效作用;但含药上清联合GCV组对肝癌细胞生长抑制率分别为(22.72±3.12)％,(26.68±1.92)％,(30.50±3.53)％;与单独自杀基因(10％ tk/GCV)组抑制率(15.37±3.96)％比较,差异均有统计学显著性意义;q值分别为1.50,1.75,2.24,均大于1.15,具有协同增效作用,并呈一定的量效关系.结论:六味地黄丸主要入血成分能刺激淋巴细胞产生某些活性物质,并发挥了对HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统对肝癌CBRH7919细胞杀伤的增效作用,这些淋巴细胞产生的内源性活性物质可能才是六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础.     

miR-181a-5p在ACS患者血清中表达及对人HCASMC细胞增殖迁移的调控作用、与ADAMTS1靶向关系

目的 观察微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)在急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）患者血清中的表达及对人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC）增殖和迁移的调控作用,探讨miR-181a-5p与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶1(ADAMTS1)的靶向关系。方法 采集100例ACS患者[ACS组,其中急性心肌梗死（AMI）患者55例、不稳定心绞痛（unstable angina pectoris,UAP）患者44例]、40例冠脉造影结果阴性者（对照组）的外周静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测两组血清miR-181a-5p。取对数生长期HCASMC细胞,分为一、二、三、四组,采用脂质体转染法分别转染miR-181a-5p模拟物（miR-181a-5p mimics）、模拟物阴性对照（mimics-NC）、miR-181a-5p抑制物（miR-181a-5p inhibitor）及抑制物阴性对照（inhibitor-NC）,培养48 h时采用CCK-8法测算细胞...     

止痛膏治疗疮疡86例

目的：观祭止痛膏对疮疡的消肿止痛、祛腐生肌的作用。方法：将疮疡病人随机分为外用止痛膏组(治疗组),清疮包扎、抗炎组(对照组),观察止痛及伤口愈合的效果。结果：治疗48h后,治疗组Ⅰ度78例(90．7％),Ⅱ度8例(9．3％),对照组Ⅰ度17例(53．1％),Ⅱ度15例(46．9％)。治疗7天后,治疗组治愈67例(77．9％),对照组治愈19例(59．4％)。结论：止痛膏具有明显的消肿止痛、祛腐生肌的功能,未发现毒副作用。     

三黄片调和物外用安全性研究

目的:观察三黄片用油调和后外用对皮肤软组织感染的安全性。方法:用小鼠40只,设基质对照组和给药组,两组分别在脱毛区涂敷调和油0.2 mL、三黄片油调和物0.4 g进行急性毒性实验。豚鼠20只背两侧脱毛后,左侧均匀涂敷三黄片油调和物1.0 g/只,右侧涂敷调和油1.0 mL/只,进行皮肤刺激试验。豚鼠30只随机分三黄片调和物组,基质对照组,阳性对照组,各组左侧脱毛区分别均匀涂敷三黄片调和物0.5 g/只、调和油0.5 mL/只、1%的2,4-二硝基氯苯0.5 mL/只,进行皮肤过敏性试验。结果:三黄片油调和物外用对皮肤软组织无明显毒性,给受试物后小鼠饮食、活动均未出现异常,持续观察7d,未见动物死亡;皮肤刺激反应评分:1,24,48 h基质对照均为0分,调和物组分别为1,0,2分,判断为三黄片调和物无明显刺激性;皮肤过敏性实验中基质对照组、调和物组豚鼠皮肤均未出现红斑、水肿等过敏反应,致敏率分别为10%,0,即无明显过敏反应。结论:三黄片调和物临床外用安全,可临床推广。