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吴豪陕江帆季晓飞田月吴倩文陈思李波清封建凯赵慧琳 《中国病原生物学杂志》2023,(2):168-173
目的 在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法 以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法:以预先构建的基因敲除载体pSJHK的衍生质粒pSJHK4为载体,构建gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,使用Hp鞭毛高表达基因flaA的启动子调控gfp的表达;以hp0547基因区域为插入位点,通过自然转化的方式将质粒转入细菌,胞内通过同源重组将gfp插入到Hp基因组中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。穿梭质粒法:将含有鞭毛基因flaA启动子和gfp基因的表达盒连入H.pylori-E.coli穿梭质粒pCHFHP中,构建表达质粒pCHFHP-gfp,自然转化到Hp中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。用同样方法构建Hp CagA蛋白(融合有His-tag)的表达质粒pCHFHP-CagA,转入预先构建的Hp CagA敲除株,通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot检测CagA的表达情况。结果 构建了gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,转入Hp后细菌发出绿色荧光;基于穿梭质粒构建了gfp基因表达质粒pCHFHP-gfp,转入Hp中细菌同样发出荧光;进一步构建了CagA的表达质粒并转入Hp CagA敲除株中,Western blot检测到CagA蛋白,并体外纯化获得一定量蛋白。结论 基于同源重组基因敲入和穿梭质粒的方法可在Hp中构建外源基因及Hp自体基因的过表达体系,该方法能够为Hp的基因功能研究和致病因子的发掘提供基因操作工具。 相似文献
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目的优化牡丹皮提取条件,建立同时测定牡丹皮中没食子酸、芍药苷和丹皮酚3种有效成分含量的反相高效液相色谱分析方法。方法采用Agilent Plus C18柱,以乙腈-0.6%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0ml/min,检测波长254nm,进样量10μl。结果回归方程分别为:没食子酸Y=16.5980X+4.9502,r=0.9999;芍药苷Y=1.6131X+0.9951,r=0.9999;丹皮酚Y=5.9817X+54.1030,r=0.9997。线性范围分别为4.0~100.1;20.6~515.0;33.3~832.0μg/ml。平均回收率分别为100.7%、99.2%、97.8%;RSD(n=9)分别为1.6%、3.0%、1.1%。结论考察了牡丹皮的提取条件,提取效果良好,分析方法准确可靠,重复性好,回收率高,适用于牡丹皮的含量测定。 相似文献
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目的 探讨金丝桃苷对高糖诱导视网膜周细胞(RPCs)损伤的保护作用,并对其可能机制做出初步探索。方法 将RPCs正常培养传代后接种至细胞培养板,按不同处理分为5组:正常葡萄糖(NG)组(葡萄糖5 mmol/L)、高糖(HG)组(葡萄糖20 mmol/L)、甘露醇(MT)组(葡萄糖5 mmol/L、渗透压20 mmol/L)、高糖+低浓度金丝桃苷(HG+L-HY)组(葡萄糖20 mmol/L、金丝桃苷100μg/mL)、高糖+高浓度金丝桃苷(HG+H-HY)组(葡萄糖20 mmol/L、金丝桃苷400μg/mL)。培育相应时间后,CCK-8法检测各组RPCs活性,Annexin V/PI及TUNEL法检测RPCs凋亡率,Real-time PCR及Western Blot法检测RPCs中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、Gasdermin-D蛋白-N(GSDMD-N)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-18(IL-18)mRNA及蛋白表达水平。结果 与NG组比较,HG组RPCs活性降低,凋亡率升高(P<0.01),NLRP3、c... 相似文献
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远程医学是一项逐渐被大众接受的新型医疗服务模式。当前远程医学需要统一规划、系统设计,区别应用、分类管理。在发展中面临收费不规范、综合成本高、产业发展乏力、运营模式不成熟等诸多问题,需要出台相关政策,规范和促进远程医学健康发展。 相似文献