ILK SiRNA对TGF-β2诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨小干扰RNA(the small interference RNA,SiRNA)沉默整合素链接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因对转化生长因子-β₂(transforming growth factor beta 2,TGF-β₂)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)增殖和凋亡的影响。

方法：体外培养HTFs细胞,波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(keratin)免疫荧光染色进行鉴定。实验分组包括NC组：正常对照HTFs; H+T组：HTFs+5μg/L TGF-β₂; H+T+NC SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L阴性对照SiRNA; H+T+ILK SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L ILK SiRNA。50nmol/L ILK SiRNA转染HTFs细胞,5μg/LTGF-β₂刺激后,分别利用Western-blot检测细胞内ILK的蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖能力,Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡。

结果：Western-blot结果显示,TGF-β₂可以明显上调HTFs细胞内ILK的表达,ILK SiRNA可以明显抑制TGF-β₂诱导的ILK蛋白表达(P<0.05)。CCK-8检测结果显示,5μg/L TGF-β₂可以促进HTFs细胞增殖,ILK SiRNA转染后48h,细胞的增殖明显受到抑制,且低于正常对照组(P<0.05)。Hoechst 33342/PI双染结果显示,TGF-β₂并不诱导HTFs细胞发生凋亡(P>0.05),但ILK SiRNA可以诱导HTFs细胞发生明显凋亡,并出现少量坏死细胞(P<0.05)。

结论：ILK SiRNA可以抑制TGF-β₂诱导的HTFs增殖,并诱导HTFs细胞发生凋亡。     

荷载Zebularine的聚合物胶束复合体纳米颗粒对兔眼晶状体后囊膜混浊的预防作用

目的　研究荷载Ｚｅｂｕｌａｒｉｎｅ（Ｚｅｂ）的聚合物胶束复合体（ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬ）纳米颗粒（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ,ＮＰｓ）对兔晶状体后囊膜混浊（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｃａｐｓｕｌｅｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ,ＰＣＯ）的预防作用。方法　选取３２只新西兰白兔随机分为生理盐水对照组（Ｃ组）、游离Ｚｅｂ组（ＺｅｂＦ组）、荷载Ｚｅｂ的ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬＮＰｓ组（ＺｅｂＮＰｓ组）、ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬ空载颗粒组（ＮＰｓ组）,所有动物行晶状体摘出＋人工晶状体植入术,Ｃ组术毕球结膜下注射生理盐水０．１ｍＬ,ＺｅｂＦ组注射０．４ｇ·Ｌ－１的游离Ｚｅｂ０．１ｍＬ,ＺｅｂＮＰｓ组注射０．４ｇ·Ｌ－１荷载Ｚｅｂ的ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬＮＰｓ０．１ｍＬ,ＮＰｓ组注射ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬ空载颗粒０．１ｍＬ。术后采用裂隙灯观察前房反应和ＰＣＯ分级,动态测量眼压,高效液相色谱法测定房水中Ｚｅｂ浓度。结果　术后１ｄ、３ｄ各组间前房反应差异无统计学意义（Ｈ＝５．２１,Ｐ＝０．５９）。术后各组间对应时间点眼压差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。术后１ｄ、２ｄＺｅｂＮＰｓ组房水中Ｚｅｂ含量显著高于ＺｅｂＦ组（均为Ｐ＜０．０１）,术后３ｄＺｅｂＦ组房水中已经检测不到Ｚｅｂ,术后２ｄＺｅｂＮＰｓ组房水中药物含量最高,随后降低。术后１０周ＺｅｂＦ组、ＮＰｓ组、Ｃ组均发生了明显的ＰＣＯ,ＺｅｂＮＰｓ组ＰＣＯ较ＺｅｂＦ组显著减轻（Ｈ＝９．９１,Ｐ＜０．０５）。结论　荷载Ｚｅｂ的ＭｅＰＥＧ-ＰＣＬＮＰｓ可通过增高房水中Ｚｅｂ浓度有效减轻兔眼晶状体摘出术后ＰＣＯ程度。     

二氢睾酮对小鼠角膜上皮细胞Mucins表达的影响

目的　探讨不同浓度二氢睾酮（ＤＨＴ）对角膜上皮黏蛋白Ｍｕｃｉｎｓ表达的影响。方法　体外原代培养ＢＡＬＢ／ｃ小鼠角膜上皮细胞,分为空白对照组以及ＤＨＴ干预组,ＤＨＴ干预组给予不同浓度（０．０５ｇ?Ｌ－１、０．１０ｇ?Ｌ－１、０．２０ｇ?Ｌ－１、０．５０ｇ?Ｌ－１、１．００ｇ?Ｌ－１）ＤＨＴ干预２４ｈ;采用ＲＴ-ＰＣＲ方法与免疫荧光组织化学方法分别检测Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４ｍＲＮＡ以及蛋白水平的表达。结果　Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４ｍＲＮＡ检测结果显示:空白对照组,０．０５ｇ?Ｌ－１、０．１０ｇ?Ｌ－１、０．２０ｇ?Ｌ－１、０．５０ｇ?Ｌ－１ ＤＨＴ干预组Ｍｕｃ１ｍＲＮＡ相对表达量分别为１．００±０．００、０．１５±０．０１、１．４０±０．０９、０．０７±０．１１、０．０６±０．０２;Ｍｕｃ４ｍＲＮＡ相对表达量分别为１．００±０．００、０．３０±０．２８、１．３６±０．０５、０．４３±０．０１、０．４５±０．０１,０．１０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４ｍＲＮＡ表达水平较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;０．０５ｇ?Ｌ－１、０．２０ｇ?Ｌ－１、０．５０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组表达均下降,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。免疫荧光化学检测结果示,以上各组Ｍｕｃ１ＯＤ值分别为１．８６±０．０１、１．８２±０．０１、２．０３±０．０４、１．８８±０．０１、１．８１±０．０２,０．１０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组Ｍｕｃ１表达较空白对照组明显增加,０．０５ｇ?Ｌ－１、０．５０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组表达均下调,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;Ｍｕｃ４ＯＤ值分别为１．８６±０．００、１．７７±０．０１、１．８４±０．０２、１．９２±０．００、１．６９±０．０５,０．１０ｇ?Ｌ－１与０．２０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组Ｍｕｃ４表达较空白对照组明显增加,０．０５ｇ?Ｌ－１、０．２０ｇ?Ｌ－１、０．５０ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ干预组表达均下调,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。０．５０ｇ?Ｌ－１与１．００ｇ?Ｌ－１ＤＨＴ可影响细胞体外生长。结论　一定浓度ＤＨＴ（如０．１０ｇ?Ｌ－１）可上调小鼠角膜上皮细胞Ｍｕｃ１与Ｍｕｃ４的表达水平;而高浓度（０．５０ｇ?Ｌ－１与１．００ｇ?Ｌ－１）ＤＨＴ对角膜上皮细胞存在毒性作用。     

大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞自噬和副凋亡的发生

目的：观察急性高眼压后不同时间点大鼠视网膜神经节细胞中自噬及副凋亡的发生,并探讨其机制。

方法：将50只健康成年SD雄性大鼠随机分为正常对照组、急性IOP损伤3d,1、4、8wk组。利用高眼压(elevated intraocular pressure,IOP)前房灌注法建立SD大鼠急性IOP损伤模型,取各组大鼠的视网膜组织,采用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达; 利用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞质中自噬体及胞质空泡的产生,验证自噬及副凋亡的发生。

结果：透射电镜观察可见大鼠RGCs细胞质中包裹着电子致密物的双层或多层膜的自噬泡,正常对照组、急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组,RGCs细胞质中每50μm²自噬泡数量分别为0.79±0.43、2.14±0.36、2.29±0.47、1.57±0.51、1.21±0.43个,急性IOP损伤后各组大鼠RGCs内每50μm²自噬泡数量均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)仅见少量LC3阳性表达,LC3阳性细胞百分比15.90%。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠GCL中LC3阳性细胞百分比均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠每200μm内RGCs数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP后3d持续至8wk透射电镜观察可见大量由线粒体和/或内质网肿胀形成的细胞质空泡。

结论：急性IOP损伤后RGCs涉及自噬和副凋亡的激活,各种类型的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性IOP后视网膜神经节细胞的损伤。     

以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定

目的构建以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体,并对其进行鉴定。方法以pEGFP-NI质粒为模板,PCR法扩增获得EGFP基因片段,并将其亚克隆入PGL3-promoter质粒骨架,得到以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒pEGFP-enhancer。人工合成不同拷贝的缺氧反应元件（HRE）增强子序列,插入到pEGFP-enhancer多克隆位点获得重组质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HR,以脂质体LipofectamiIle2000转染Hela细胞,常氧与缺氧处理后以荧光显微镜及流式细胞仪观察EGFP荧光表达。结果构建的不同拷贝HRE的增强子鉴定质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HRE转染Hela细胞后,常氧处理绿色荧光表达无差异,缺氧处理后随HRE拷贝数增加绿色荧光表达强度增加。结论成功构建了增强子表达质粒pEGFP-enhancer,通过EGFP的表达强度可以反应增强子活性。     

雄激素与干眼

干眼是眼科常见疾病,在人群中其患病率随年龄的增长而增加,女性更为常见.研究发现雄激素可影响泪膜的功能,可能影响干眼的发生.本文就雄激素对干眼的影响作一综述,旨在为进一步的研究以及临床应用奠定基础.     

单穿刺双切口青光眼白内障联合手术的临床观察

目的：探讨单穿刺双切口青光眼白内障联合手术的方法和效果。 方法：对28例30眼青光眼合并白内障患者行改良的单穿刺双切口青光眼白内障联合手术。常规白内障超声乳化手术（10∶00位透明角膜切口）后,11∶00~1∶00位距角膜缘后2mm处剪开球结膜及Tenon囊,3mm穿刺刀于角膜缘后2 mm穿刺入前房,作一3 mm宽、1/3~1/4巩膜厚度的巩膜隧道,伸入小梁咬切器,咬除3块约1mm×1mm大小小梁组织。术后随访3~6 mo观察视力、眼压、滤过泡形态（ OCT检测）及并发症的情况。 结果：术后1wk,视力〈0.1者3眼,0.1~者6眼,0.3~者13眼,0.6~0.8者8眼;1眼发生恶性青光眼,8眼早期角膜水肿及瞳孔区轻微纤维素渗出;30眼均为功能性滤过泡（Ⅰ型、Ⅱ型滤过泡）, OCT显示滤过口通畅;随访3~6mo,28眼眼压在正常范围内,2眼出现眼压控制不良。结论：单穿刺双切口青光眼白内障联合手术简单易行,手术效果良好,术后并发症少,值得推广。     

HIF-1α和Pax6在翼状胬肉中的表达及其意义

目的：检测缺氧诱导因子( HIF-1α)和干细胞标志物( Pax6)在患者翼状胬肉组织中的表达,比较其与正常结膜组织中的变化,以探讨HIF-1α和Pax6的表达与翼状胬肉之间的关系。
　　方法：选取35例翼状胬肉患者切除的翼状胬肉组织为实验组,同时选取10例正常人结膜组织为对照组,使用常规免疫组织荧光染色法对HIF-1α和 Pax6的表达进行检测并与染色进行对照。
　　结果：实验组35例组织中HIF-1α的阳性表达率为66%(23/35),正常对照组10例组织中HIF-1α的阳性表达率仅为10%(1/10),HIF-1α表达在正常球结膜与翼状胬肉两组间的表达有统计学差异(P<0.05)。正常人球结膜Pax6在组织各层细胞核内表达,而Pax6在翼状胬肉组织中表达下降甚至未见表达,两组比较有统计学差异(P<0.05)。
　　结论：HIF-1α在翼状胬肉中高表达,提示它可能参与了翼状胬肉的病理过程;Pax6基因在翼状胬肉上皮细胞中表达下调,提示翼状胬肉上皮细胞病理过程属于鳞状上皮化生类型。     

荷载Zebularine的聚合物胶束复合体纳米颗粒对体外培养的晶状体上皮细胞增殖和黏附的影响

目的：：研究荷载 Zebularine ( Zeb )的聚合物胶束复合体( MePEG-PCL)纳米颗粒( NPs)对体外培养的晶状体上皮细胞( LECs)活性、黏附性和凋亡的影响。方法：体外培养胎儿晶状体组织HLE B-3永生细胞,分为6个组,分别给予游离Zeb 50μmol/L ( ZebF1组)、100μmol/L ( ZebF2组)、荷载 Zeb 的 MePEG-PCL NPs 50μmol/L (ZebNP1组)、100μmol/L(ZebNP2组)、MePEG-PCL空载颗粒( NPs组)、空白培养基( C 组),分别采用 MTT 比色法、改良MTT 比色法观察细胞活性、黏附性,采用 DNA ladder法研究细胞凋亡。结果：MTT比色法显示：游离Zeb和荷载Zeb的MePEG-PCL NPs对细胞活性有抑制作用,均呈时间-剂量依赖性增强( P<0.05),与游离组相比,相同剂量荷载Zeb的MePEG-PCL NPs组在给药12 h时细胞活性无差异,而给药24,48,96 h后载体组细胞活性降低( P<0.05)。改良MTT比色法显示：所有Zeb给药组细胞黏附率均降低,与游离组相比相同剂量荷载Zeb的MePEG-PCL NPs组黏附率降低( P<0.05)。 DNA ladder显示：给药后96h C组、NPs组,ZebF1组未出现DNA碎片表达, ZebF2, ZebNP1, ZebNP2组出现DNA碎片表达,其表达强度依次为 ZebNP2> ZebNP1>ZebF2( P<0.05)。结论：荷载Zeb的MePEG-PCL NPs可有效地抑制体外培养的LECs活性、黏附性,造成细胞的凋亡,其效果优于同剂量的游离药物。     

OCTA与FFA在小鼠脉络膜新生血管模型中应用的比较研究

目的　以脉络膜铺片为金标准,探讨小鼠脉络膜新生血管（CNV）模型中荧光素眼底血管造影（FFA）与光学相干断层扫描血管成像（OCTA）描述小鼠CNV形态准确性的差异。方法　应用激光诱导制作小鼠CNV模型,在激光造模后第7、14天分别利用FFA、OCTA进行小鼠眼底扫描,并与小鼠脉络膜铺片结果进行对比,寻找与脉络膜铺片一致性最高的检查技术。结果　CNV模型小鼠眼底经测量的FFA、眼底激光成像、OCTA与脉络膜铺片中激光斑的面积,通过ICC一致性分析发现:以脉络膜铺片作为金标准,与它一致性最显著的为FFA,眼底激光成像次之,缺乏一致性的为OCTA。以此得出结论:对于小鼠CNV模型眼底CNV的形态,FFA检查与脉络膜铺片的一致性较好;OCTA与脉络膜铺片的一致性弱于FFA。结论　OCTA、FFA以及多重眼底照相都可以描述小鼠CNV的形态,但FFA仍是描述CNV形态较为准确的工具。