检测HIV-1耐药株的异源双链泳动分析技术的建立及临床应用

目的探讨利用异源双链泳动分析技术(HMA)检测HIV-1耐药株的可行性和临床应用。方法从接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的HIV-1感染者血浆中抽提RNA,采用套式RT-PCR方法扩增HIV-1的PR和RT基因片段,并对扩增的基因片段进行异源双链泳动分析。结果本方法对血清中HIV-1RNA含量2000copies/ml以上的样本都能有效扩增。在18例参加HAART治疗的HIV感染者中,17例的HMA结果在聚丙烯酰氨凝胶电泳上,没有出现有意义的异源双链泳动带。1例发现有异源双链二聚体,这1例后经序列测定证实,确定有耐药位点的基因变异。结论异源双链泳动分析技术能够及时、间接地反映HIV-1在治疗过程中耐药株的存在。该方法的建立能在临床上为临床医生制定治疗方法提供参考依据。     

应用ntPCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异

目的建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒（HBV）阿德福韦（ADV）耐药变异-rtN236T变异及rtA181V变异的快速检测方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物，使野生株rt236NPCR产物中含有DraⅠ酶切位点（5′-TTTAAA-3′），而变异株rt236T无此限制性酶切位点；使野生株rt181APCR产物中含有BlpⅠ酶切位点（5′-GCTNAGC-3′），而变异株rt181V无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBVDNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清，经PCR扩增、限制性内切酶酶切及凝胶电泳，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBVRT区基因序列分析。结果建立的ntPCR-RFLP方法可以检测到10^2copies／L的HBVDNA；RFLP分析结果与DNA测序结果一致，4份血清标本中检测到1份rtN236T变异，2份rtA181V变异。结论应用ntPCR-RFLP方法检测HBV阿德福韦耐药变异具有灵敏、特异、简便的优点，适用于HBV耐药变异的监测。     

表达HBeAg和HBsAg对HepG2细胞系细胞因子分泌及ACE活性的影响

目的:观察HBeAg和HBsAg对人肝癌细胞系 HepG2细胞中血管紧张素转化酶(ACE)分泌的影响．方法:利用本所既往构建的表达乙肝病毒 (HBV)表面抗原和E抗原的真核表达载体 pcDNA3．1(-)-HBsAg、pcDNA3．1(-)-HBeAg 及空载体pcDNA3．1(-)转染HepG2细胞,观察转染24,48 h后细胞上清中ACE活性和炎性细胞因子IL-6、IL-8的变化．培养细胞上清液内 ACE活性采用底物裂解法检测;IL-6、IL-8浓度采用流式细胞仪检测．结果:转染48 h的HepG2细胞裂解液中检测到了HBsAg和HBeAg的表达,但二者细胞上清中的ACE与转染空载体对照pcDNA3．1(-)细胞上清中的ACE无显著差异;同样,炎性因子 IL-6和IL-8也没有显著差异．结论:HBV HBsAg和HBeAg对ACE活性、 IL-6和IL-8不具有显著的上调或下调作用; HBsAg和HBeAg在肝纤维化发生过程中的作用机制尚待进一步阐明．     

GLS 3’-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定

目的构建颗粒溶素基因3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)-荧光素酶报告质粒,检测颗粒溶素和微小RNA(miRNA)调控位点的关联性。方法将人工合成的GLS基因3’-UTR区序列,克隆至荧光素酶报告质粒pGL3-control;通过Targetscan5.1等软件预测可能与GLS基因3’-UTR作用的miRNA;将荧光素酶报告质粒和miRNA真核表达质粒共转染293T细胞,为防止脱靶效应,同时转染anti-mir-inhibitor和anti-mir-control,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果用Targetscan5.1软件、PicTar软件和miRBase数据库预测交叉结果显示,miRNA(mir)-218、mir-514、mir-185、mir-611均与GLS基因3’-UTR存在互补结合位点;构建的miRNA真核表达质粒和荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确;2种质粒共转染293T细胞后,miRNA-218可使荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低75%左右(P<0.01);转染anti-mir-inhibitor后,荧光素酶的表达恢复到正常水平。结论成功构建了GLS基因3’-UTR荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性,筛选出和GLS表达相关的miRNA片段即miRNA-218,为探讨miRNA调控GLS表达机制打下实验基础。     

99mTcO4异位胃黏膜显像对儿、梅克尔憩室的诊断价值

目的 评价99m高锝酸盐(99mTcO4)异位胃黏膜显像对儿童梅克尔憩室的诊断价值.方法 对34例下消化道出血疑诊为梅克尔憩室的患儿行99mTcO4异位胃黏膜显像,对显像结果与临床最终诊断结果进行比较.结果 34例患儿中,阴性显像13例,均排除梅克尔憩室.阳性显像21例,病变在右下腹的患儿15例,经手术病理证实为梅克尔憩室;病变在右下腹以外部位6例均为假阳性,经外科或内窥镜等检查证实其中3例为肠溃疡,1例为刺伤,2例病因未明.99mTcO4异位胃黏膜显像诊断梅克尔憩室的灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为100.00%、82.35%、71.43%和100.00%;特别对于右下腹阳性显像病例,其灵敏度、特异性、阳性预测值均达到100.00%.结论 99mTcO4异位胃黏膜显像是一种无创、有效和简单易行的诊断儿童梅克尔憩室的首选影像学方法,特别对于显像阳性部位在右下腹的患儿,具有更高的诊断价值.     

黄体生成素受体对睾丸间质干细胞增殖分化的影响

目的 探讨黄体生成素受体（LHCGR）对睾丸间质干细胞（SLC）增殖及分化能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及免疫荧光染色比较LHCGR^-/-小鼠与LHCGR^+/+小鼠睾丸内SLC标志物的表达情况。通过流式细胞术分选出SLC,进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）及CCK-8增殖实验。同时诱导SLC向睾丸间质细胞（LC）分化,14 d后检测上清液睾酮水平。qRT-PCR及免疫荧光检测诱导分化后LC标志物表达水平。结果 LHCGR^-/-小鼠睾丸内存在SLC,应用CD51标记并通过流式分选可获得SLC。LHCGR^-/-小鼠SLC EdU⁺细胞比例和CCK-8增殖曲线与LHCGR^+/+小鼠比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。LHCGR^-/-小鼠SLC诱导分化后培养基上清液睾酮平均水平仅为0.01 ng/ml,低于LHCGR^+/+对照组的2.71 ng/ml （P < 0.001）,其诱导分化后细胞LC标记物的表达也低于LHCGR^+/+小鼠（P均< 0.001）。结论 敲除LHCGR基因后,睾丸内存在SLC且能维持正常的增殖活性,但是分化为LC受阻。     

蒲公英酚类特征成分含量测定及其特征图谱质量表征关联分析

目的:建立蒲公英酚类特征成分的含量测定方法及其酚类特征图谱质量表征关联分析方法,应用关联分析评价模式,以有效、精准地评价蒲公英饮片质量。方法:采用HPLC对15批蒲公英饮片中的酚类特征成分(原儿茶酸、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、异绿原酸A和菊苣酸、木犀草素、木犀草苷)进行含量测定。建立蒲公英酚类特征图谱,基于特征图谱中特征峰的梳理及所属化学类型对15批蒲公英饮片进行质的表征;基于特征图谱中特征成分原儿茶酸,单咖啡酰酒石酸,绿原酸,咖啡酸,对香豆酸,异绿原酸A,菊苣酸,木犀草苷,木犀草素及酚酸类(以咖啡酸表征),黄酮类(以木犀草素表征)的含量和峰面积分别对15批蒲公英饮片进行量的表征,并基于基准饮片对15批蒲公英饮片质与量的表征结果进行关联性分析。结果:各特征成分均具有良好的线性关系,方法学考察符合定量要求。以样品S1为基准饮片,在蒲公英酚类特征图谱中共含有14个特征峰,其中酚酸类成分特征峰10个,黄酮类成分特征峰4个,15批饮片色谱图中均含有此14个特征峰。采用质量表征关联分析与评价模式,得出特征成分含量总体较高的样品为S3,S14,S4,S6,S9和S12;与基准饮片关联度较高的样品为S10,S6,S12,S7和S2;综合评价得优良度居前的样品为S6,S12,S3,S10和S1。结论:所建立的蒲公英酚类特征成分含量测定方法简便、准确,构建的蒲公英酚类特征图谱质量表征关联分析模式可用于分析蒲公英饮片的质量与应用有效性,可有效精准地评价蒲公英的质量。     

谱效关系分析在中药组方研究中的应用进展

中药谱效关系是在中医药理论现代研究的基础之上,将中药指纹图谱与药效学研究结果通过化学计量学模型进行关联,建立起中药指纹图谱与疗效内在关系的一门学科。谱效关系理论的建立,在一定程度上解决了中医药研究中存在的有效成分分析与疗效研究相脱离的问题,为从复杂中药成分中挖掘出真正的疗效组分提供了有效的研究方法和手段。近年来,谱效关系研究被广泛应用于中药的质量评价、有效成分筛选、药效物质基础研究、制备工艺优选等诸多方面。本文综述汇总了近年来谱效关系在中药方剂及配伍药对方面的研究文献,分别从实验方法设计、数据分析方法和研究缺陷等方面阐述谱效关系在中药组方中的应用进展情况,以期为今后复方中药的研究提供理论支持。     

铁饱和重组人乳铁蛋白对大鼠缺铁性贫血的恢复作用

目的：研究铁饱和重组人乳铁蛋白（iron saturated recombinant human lactoferrin,Fe-rhLf）对缺铁性贫血的恢复作用。方法：实验用4周龄雄性SD大鼠喂饲低铁饲料（铁含量8.9 mg/kg）和去离子水。实验第4周选取血红蛋白小于100 g/L的大鼠,按体重和血红蛋白水平分为贫血模型对照组、硫酸亚铁阳性对照组和3个Fe-rhLf干预组进行贫血恢复试验。硫酸亚铁对照组以5.43 mg/(kg·d)硫酸亚铁灌胃,折合铁离子含量2.0 mg/(kg·d);3个Fe-rhLf干预组分别以Fe-rhLf 75.53、151.06和302.11 mg/(kg·d)灌胃,分别折合铁离子0.5、1.0和2.0 mg/(kg·d),为平衡各组蛋白质灌胃量,贫血模型对照组每天灌胃给予100 mg/(kg·d) 酪蛋白去离子水溶液,其余干预组补充酪蛋白至100 mg/(kg·d)。实验期间记录大鼠体重,30 d后处死动物,检测血常规指标、血清抗氧化指标以及肝铁调素和膜铁转运蛋白mRNA的表达。结果：与贫血模型对照组比较,Fe-rhLf可以明显加快缺铁性贫血大鼠体重恢复(P<0.05),提高血红蛋白(P<0.01)和红细胞计数(P<0.01)等血液学指标及抗氧化指标,同时上调肝铁调素表达,下调膜铁转运蛋白表达。与硫酸亚铁对照组比较,高剂量Fe-rhLf［302.11 mg/(kg·d)］可以明显提高血红蛋白(P<0.05)。结论：与硫酸亚铁比较,饱和重组人乳铁蛋白对治疗缺铁性贫血具有更好的疗效。     

多壁碳纳米管改善激素性股骨头坏死模型兔的股骨头形态

背景：碳纳米管可以促进成骨细胞的增殖和分化,可能对激素性股骨头坏死发挥治疗作用。 目的：观察多壁碳纳米管在激素性股骨头坏死模型建立过程中的作用。方法：36只新西兰大耳白兔随机选出32只等分为治疗组和模型组,剩余4只作为空白组。治疗组兔每天臀肌注射地塞米松2.5 mg/kg,每周向双侧股骨的骨髓腔内各注射0.1 g/L多壁碳纳米管悬浊液1 mL;模型组每天臀肌注射地塞米松2.5 mg/kg,每周向双侧股骨的骨髓腔内各注射生理盐水1 mL,空白组每天臀肌注射生理盐水2 mL,每周向双侧股骨的骨髓腔内各注射生理盐水1 mL。结果与结论：模型组兔股骨头组织中骨小梁开始少量出现变细断裂,骨髓脂肪化十分明显,脂肪细胞肥大,微血管开始出现血栓;而经多壁碳纳米管悬浊液治疗的兔股骨头病理损伤出现明显改善。提示多壁碳纳米管能在一定程度上改善激素性股骨头坏死的病理损伤。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：