利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的：构建含目的基因葛佬素(Gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(Rapid Translation System)对其进行表达。方法：采用PCR方法扩增gloverin cDNA,将其与表达载体pIVEX2．3连接；采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500，使其蛋白能在大肠杆菌(E．coli)裂解产物中进行表达。     

杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽中和内毒素作用的研究

目的　观察 4种杀菌性 /通透性增加蛋白 (BPI)模拟肽 (10 342、10 343、10 344、10 345 )体内外中和内毒素 (LPS)的作用。　方法　采用定量鲎基质显色法测定BPI模拟肽体外中和LPS的能力 ;采用尾静脉给药方法 ,观察BPI模拟肽对LPS攻击小鼠的保护作用 ;测定BPI模拟肽对LPS血症模型大鼠TNFα及IL 6影响。　结果　BPI模拟肽具有中和LPS的能力 ,中和能力随浓度增加而增加 ,其中 10 342的作用最强 ;不同BPI模拟肽对LPS血症小鼠具有强大的保护作用 ,保护率达 90 % ,并可明显降低LPS血症模型大鼠各时相点血清TNFα及IL 6水平。　结论　杀菌性 /通透性增加蛋白 (BPI)模拟肽不仅具有体外中和LPS的能力 ,而且对LPS血症动物具有强大的保护作用。     

氯喹对内毒素、细菌DNA诱导的TLR4、TLR9表达的作用研究

目的 :内毒素 (LPS)、细菌DNA均为全身炎症反应综合征 (SIRS)的主要启动因素。氯喹 (CQ)为抗疟药 ,具有抗炎作用 ,能够拮抗LPS、细菌DNA诱导的细胞因子释放 ,但其作用机制尚不清楚。本研究旨在观察CQ对TLR4、TLR9表达的影响 ,探讨CQ拮抗LPS、细菌DNA的可能机制。方法 :体外培养小鼠巨噬细胞系ANA 1 ;实验分正常对照 (去热原水 )组、LPS1 μg/ml刺激组、大肠杆菌DNA(ECDNA) 1 0 μg/ml刺激组及相应的CQ 1mg/ml处理组 ,CQ在加去热原水、LPS、ECDNA刺激前 2h给药 ;采用RT PCR技术 ,观察LPS、ECDNA刺激组及CQ处理…     

黄芩抗内毒素组分的制备及其生物学活性研究

目的:研究从黄芩中分离提取拮抗内毒素(LPS)组分的制备方法及其生物学活性。方法:采用大孔吸附树脂AB-8将黄芩水提物分离成若干组分,应用生物传感器技术检测各组分与LPS的活性中心LipidA的结合活性,ELISA法检测各组分对LPS刺激RAW264.7细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响;由此筛选出能与LipidA结合并对LPS刺激的RAW264.7细胞活化具有抑制作用的组分,进一步观察所得组分对脓毒血症模型动物的保护作用。结果:采用大孔吸附树脂AB-8从黄芩中共分离到5种组分(SbG-1～5),其中SbG-4、SbG-5与LipidA具有较高结合活性,特异性结合值(RU)分别为113.36arc/s、73.75arc/s;SbG-4、SbG-5(100mg/L)可显著抑制LPS(100μg/L)诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α(P<0.05);SbG-4能显著提高热灭活大肠杆菌(1.33×1011CFU/Kg)所致脓毒血症小鼠的72h存活率(P<0.05),并呈剂量效应关系。结论:从黄芩中分离提取的具有拮抗LPS活性的SbG-4可抑制LPS刺激的RAW264.7细胞活化,并对脓毒血症模型动物具有显著的保护作用。     

葛佬素的原核表达及其在牙髓细胞中的抗炎效应研究

目的:采用原核表达系统表达抗菌肽葛佬素,并观察其对原代牙髓细胞炎性细胞因子IL-1β分泌的影响。方法:应用pET原核表达系统进行目的蛋白的表达,应用蛋白免疫印迹对蛋白进行鉴定,并采用ELISA方法,观察重组葛佬素对内毒素诱导的牙髓细胞IL-1β释放的影响。结果:原核表达产物经蛋白免疫印迹鉴定,为融合有聚组氨酸标签的葛佬素抗菌肽,ELISA检测结果表明,该表达产物能够以剂量依赖方式抑制LPS诱导的IL-1β释放。结论:在原核表达系统中成功表达了具有生物活性的抗菌肽葛佬素,该表达产物可以抑制牙髓细胞炎性因子IL-1β的释放。     

地骨皮提取物CL-5拮抗内毒素的实验研究

目的 观察地骨皮提取物(CL-5)对内毒素(LPS)的体内外拮抗活性.方法 应用生物传感器技术检测CL-5与LPS的活性中心类脂A(Lipid A)的结合活性,ELISA法检测不同浓度CL-5(50、100、200mg/L)对LPS(100μg/L)刺激RAW264.7细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,进一步观察不同剂量(30、60、90mg/kg)的CL-5对致死剂量热灭活大肠杆菌(E.coil)攻击小鼠的72小时存活率.结果 10～640mg/L的CL-5,特异性结合值(RU)为36.5～481.2arc/s,随CL-5浓度递增而升高;单纯LPS刺激RAW264.7细胞(对照组)释放的TNF-α为(2479.03±61.43)ng/L,给予50、100、200mg/L CL-5预处理后TNF-α浓度依次为(2 210.29±70.95)、(1 998.27±111.24)、(1 423.28±86.35)ng/L,随CL-5剂量递增而减少,均显著低于对照组(P<0.05);以1.30×1011CFU/kg热灭活E.coil攻击小鼠(对照组)72小时动物死亡率为100%,而以30、60、90mg/kg CL-5处理后,小鼠72小时存活率分别为50%、60%和80%,随CL-5注射剂量的增加而升高,均显著高于对照组(P<0.05).结论 CL-5与Lipid A有一定的结合活性,可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞活化,并对致死剂量热灭活E.coil攻击的小鼠具有保护作用.     

金黄色葡萄球菌细胞壁可溶性肽聚糖的分离纯化和鉴定

目的：从金黄色葡萄球菌中提取纯化可溶性肽聚糖并鉴定其活性。方法：采用小剂量青霉素作用金黄色葡萄球菌（ATCC25923），诱导合成可溶性肽聚糖（PGN）粗品，经Sephadex G-100凝胶层析进一步分离纯化；采用SLP试剂盒对纯化的可溶性PGN定性，ELISA法检测纯化的可溶性PGN对小鼠RAW264．7细胞的活化作用。结果：分离纯化的可溶性PGN经SLP试剂检测阳性，该可溶性PGN可刺激RAW264．7细胞释放TNF-α，并具有明显的量效关系。结论：采用青霉素诱导结合凝胶层析技术可从金黄色葡萄球菌获取纯度及生物学活性较高的可溶性PGN。     

诃子抗CPG ODN组分的分离及活性评价

目的：从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN作用的活性组分。方法：应用水提、离子色谱技术等方法，从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN活性的组分；并应用生物传感器技术，对所得到的组分进行与CPGODN结合活性的筛选；观察其对CPGODN刺激的小鼠RAW264.7细胞释放炎症介质的抑制作用。结果：应用生物传感器技术筛选出与CPGODN结合活性最高的诃子作为研究对象，应用离子色谱技术从诃子中分离出3组分，其中有3个组分均具有一定的与Lipid A的结合活性，以第3组分与Lipid A的结合活性最强；并对CPGODN刺激的小鼠RAW264．7细胞释放TNF-α具有显著的抑制作用；结论：从诃子中分离出的第3组分具有显著的拮抗CPGODN活性。     

利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapid translation system)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E.coli)裂解产物中进行表达.应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定.结果:pIVEX2.3-G重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500可表达出分子量约为14.4的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白.结论:抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达.