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目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。 相似文献
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目的:分析膀胱尿路上皮癌(BTCC)组织中ERG蛋白表达水平与微血管密度(MVD)和肿瘤分期的相关性。方法:选取62例BTCC患者的癌组织及癌旁组织石蜡标本,检测其ERG蛋白表达、程序性死亡受体配体-1(PD-L1)表达水平以及MVD水平。分析各蛋白阳性表达水平与肿瘤分期的关系,以及ERG、PD-L1蛋白与MVD的相关性。结果:BTCC癌组织中ERG阳性表达39例(62.90%),明显高于癌旁组织中的ERG阳性表达12例(23.08%)(P<0.05);BTCC癌组织中PD-L1阳性表达26例(41.94%),明显高于癌旁组织中的PD-L1阳性表达5例(8.06%)(P<0.05);BTCC癌组织的MVD水平明显高于BTCC癌旁组织(P<0.05)。ERG、PD-L1蛋白阳性表达率、MVD水平在病理类型、肿瘤分期、肿瘤数目中存在统计学差异,在浸润性癌、肿瘤高分期、多发性肿瘤中阳性表达率增高(均P<0.05)。ERG、PD-L1蛋白表达与MVD水平均呈正相关(r=0.426、0.357,P<0.05)。ERG蛋白表达与PD-L1呈正相关(r=0.512,P&... 相似文献
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