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91.
目的:构建吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库.方法:建立大鼠吗啡躯体依赖模型后,取鼠脑进行总RNA的抽提、mRNA的纯化,以mRNA为模板合成第一链cDNA后用LD-PCR方法合成双链cDNA,用限制性内切酶SfiⅠA、B分别双酶切双链cDNA与pTRG载体,连接后的cDNA文库转化XL1-Blue MRF′ Kan 超级感受态并收菌,完成cDNA文库构建.结果与结论:PCR结果显示,cDNA片段连接效率>90%,cDNA插入片段在1 kb左右.吗啡依赖大鼠脑cDNA文库总容量为3.05×106,满足下一步细菌双杂交文库筛选要求. 相似文献
92.
hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径.方法 设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesiL-HK.两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功.转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P<0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%.结论 hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗. 相似文献
93.
94.
四肢骨折术后感染的综合治疗 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]研究四肢骨折术后感染的治疗方法。[方法]自2001年6月~2005年6月,27例四肢骨折术后感染患者,术前应用全身敏感抗生素,局部彻底清创后植入载体抗生素,伴有软组织缺损者予皮瓣转移修复,术后加强营养、高压氧等支持治疗。[结果]所有患者术后平均随访2年2个月。创口均愈合,无分泌物流出,肢体红肿热痛等症状消失。术后4周骨折周围有不同程度的新骨痂生成,术后12个月除1例肱骨骨折,1例胫骨骨折,2例尺骨骨折不愈合外,其余骨折均愈合,肢体功能基本恢复正常。4例骨折不愈合者予自体髂骨植骨术,4例骨折均已愈合。[结论]综合治疗四肢骨折术后感染具有较好的效果。 相似文献
95.
目的构建重组人骨形态发生蛋白7(hBMP7)的腺相关病毒(AAV)载体。方法通过RT-PCR方法,从HEK293细胞中扩增hBMP7全长cDNA并亚克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV。将pSNAV-hBMP7质粒DNA转染BHK-21细胞,筛选出携带hBMP7的AAV载体细胞株—BHK-21细胞。用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2按MOI=0·1感染BHK-21载体细胞株后收获病毒液,通过氯仿—PEG/NaCl沉淀—氯仿抽提纯化病毒。结果所克隆的hBMP7全长cDNA经测序证实和已知hBMP7序列完全一致。通过用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染携带hBMP7基因的AAV载体细胞株BHK-21细胞的方法获得了滴度为2×1012vg/ml、纯度达99%的重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体(AAV-hBMP7)。结论RT-PCR方法从HEK293细胞中扩增克隆hBMP全长cDNA是一种有效可行的方法。成功地构建了高滴度、高纯度的AAV-hBMP7载体,为进一步体内及体外研究基因治疗促进骨愈合提供了有力的工具。 相似文献
96.
目的:探讨STAT3基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT3),使用脂质体转染人胃癌细胞系(MKN-45细胞)。实验分为对照(A)组,psiRNA-H1转染(B)组和psiRNA-H1/STAT3转染(C)组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确,并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞,能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。 相似文献
97.
目的 利用腺病毒载体(Ad)介导的CTLA4Ig基因示踪大鼠臂丛神经轴突及其运动和感觉神经元,探讨转基因产物CTLA4Ig蛋白作为神经通路示踪剂的可行性及其特点.方法 经正中神经或尺神经或肌皮神经近断端导入携带CTLA4Ig或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad(各2×107pfu).在转染后3周内6个不同时间点取标本,行CTLA41g免疫荧光染色,观察标记的运动及感觉神经元所在脊髓和脊髓后根神经节(DRGs)节段、神经根及轴突被标记范围及时间,并与EGFP基因的示踪结果比较.结果 由正中神经、尺神经和肌皮神经所标记的神经元分别在C6~Th1、c7~Th1及C5~C7节段;其相应的神经根及神经干近段轴突亦被标记.CTLA4Ig标记的神经元在转染3周后消失,所标记神经干轴突在转染5周后消失;而EGFP所标记的神经元和神经干分别2周、3周后消失.结论 CTLA4Ig基因能在Ad介导下经外周逆行性、特异性示踪臂丛神经及其靶运动和感觉神经元. 相似文献
98.
α-病毒载体在基因治疗中的作用 总被引:1,自引:0,他引:1
基因治疗是近10年来随着现代医学与分子生物学相结合而出现的,基因治疗的研究已迅速扩大到肿瘤、艾滋病、心血管病和神经系统疾病等。而且,基因载体(包括质粒、病毒和脂质体等)的研究也进展迅速,各种新型载体不断出现。近10年来,α-病毒的多个成员已经被作为表达载体,并被引入基因治疗领域,其中最常用的是森林病毒(Semliki forest virus,SFV)、 相似文献
99.
人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白.方法:采用反转录.聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中,分别扩增出Heparanase编码基因,用限制性内切酶BamHI消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定与测序证实后,连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体,以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白.结果:构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实,与GenBank登录结果完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pcDNA3.1及pRSET;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功.结论:成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体,成功正确表达了6His/Heparanase融合蛋白 相似文献
100.
纳米粒子载体携带反义转化生长因子-β1基因的局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响 总被引:2,自引:1,他引:1
目的探讨纳米粒子携带反义转化生长因子(TGF-)β1局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法45只大鼠制成自体静脉移植模型后,分成纳米粒子DNA组、纳米粒子空载体组和生理盐水对照组,进行局部定位转染,2周后观察移植静脉内膜的变化,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Westernblot以及免疫组织化学等方法检测反义基因对内源性TG-Fβ1表达的影响。结果基因转染后两周,内膜厚度为(20.5±4.7)μm,明显小于两个对照组(P<0.01)。RTPCR和Westernblot结果表明,基因转染组的TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显低于空载体组及生理盐水对照组。结论纳米粒子可有效地作为基因的转移载体;纳米粒子携带反义TGF-β1可以减少内源性TGF-β1基因的表达,抑制细胞外基质(ECM)的合成,从而达到抑制内膜增生的目的。 相似文献