超抗原SE-金葡菌肠毒素的研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素（SE）是一种外源性超级抗原,仅需微量即能能刺激非特性T细胞的大量增殖,促使产生大量和多种细胞因子及细胞毒,提高机体免疫力,使之获得抗肿瘤的能力,故是一种很有前途的新型肿瘤免疫治疗剂,目前已开始已用于肿瘤患者的辅助治疗。本文对葡萄球菌肠毒素的结构、抗肿瘤作用机理及其应用前景作了简要综述。     

胶体金免疫层析法检测葡萄球菌B型肠毒素

目的通过优化制备中各关键步骤的实验条件,建立快速检测葡萄球菌B型肠毒素的胶体金免疫层析法。方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备直径16nm的胶体金溶液,葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果用柠檬酸三钠还原法制备的16nm胶体金溶液呈亮红色,其颗粒大小比较均一。胶体金标记抗体蛋白的最低稳定量为15μg／mL,最适稳定量为18μg／mL,标记的最适pH为7．8。此方法检测限为0．2μg/mL,准确度为94．9％。结论制备了葡萄球菌B型肠毒素胶体金免疫试纸条,该方法简便、快速,而且灵敏度高、稳定性强,适用于食品中葡萄球菌B型肠毒素的快速检测。     

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究

[目的]建立一种快速、高效地检测金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC和SED基因的多重PCR法并进行优化. [方法]试剂盒提取产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板,根据SEA、SEB、SEC和SED肠毒素基因片段保守区序列设计引物,多重PCR扩增产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组中特异靶序列.对反应体系Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行优化,并初步检测方法特异性. [结果]在PCR反应体系中加入设计的4对引物可同时扩增出金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因中的特异序列;在总体积为25 μl的反应体系中,最优Mg2+浓度为2.0 mmol/L,引物浓度分别为0.2 μmol/L,退火温度为49℃;以大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板扩增不出特异片段. [结论]成功建立金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因多重PCR法,该法能快速、高效地同时检测SEA、SEB、SEC和SED基因,比传统PCR方法省时省力,可以弥补传统PCR法的不足.     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对活化T细胞端粒长度影响及其相关机制研究

目的:研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对T细胞端粒长度的作用及机制。方法:SEA、K562细胞、SEA联合K562细胞以及抗CD3单克隆抗体分别刺激脐带血单核细胞,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测端粒、hTERT及IL-7R表达。结果:SEA组、K562细胞组、SEA联合K562细胞组及抗CD3单抗组活化T细胞的端粒相对长度比值为1.63±0.08、1.06±0.06、3.24±0.61、1.37±0.07;hTERT的表达差异倍数为1.88±0.07、1.95±0.05、3.93±0.23、1.30±0.06;IL-7R表达差异倍数为6.61±0.52、12.81±0.34、17.42±0.50、4.87±0.66;SEA联合K562细胞组均明显高于其他3组(P<0.01),SEA组对端粒长度影响大于单纯K562细胞组。结论:超抗原SEA可以直接刺激T细胞的端粒酶活性及上调表达IL-7R,联合特异性抗原K562细胞株诱导T细胞活化上调效果更明显。     

超抗原SEA对人胃癌细胞株小鼠荷瘤模型作用及其机制的研究

目的　探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 (SEA)对体内肿瘤的抑瘤效果及作用机制。方法　采用人胃癌细胞 (MGC80 3 )皮下接种建立小鼠胃癌模型 (n =40 ) ,实验组 (n =2 0 )注射SEA ,对照组 (n =2 0 )注射生理盐水 ,观察肿瘤的发生率及肿瘤的重量。并对瘤体组织应用免疫组织化学方法初步探讨其发生机制。结果　超抗原SEA处理的小鼠肿瘤的发生率低于对照组 ,两者差异无显著性 ;超抗原SEA处理的小鼠肿瘤的重量明显低于对照组 ,两者差异有显著性 (P <0 .0 1) ;SEA处理的小鼠肿瘤组织有CD4 T细胞和CD8 T细胞浸润 ,而对照组很少或没有T细胞浸润。结论　超抗原SEA对小鼠胃癌细胞有明显抑瘤效果 ,其作用机制可能为SEA诱导了超抗原依赖细胞介导的细胞毒效应所致     

重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N的表达、纯化及生物学活性的研究

 目的表达、纯化重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N(rSEB-D9N),了解表达产物rSEB-D9N的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和肿瘤生长抑制作用。方法不同浓度IPTG诱导SEB-D9N突变体原核表达系统pET32a-SEB-D9N-E.coliBL21DE3表达rSEB-D9N,经Ni-NTA亲和层析法纯化rSEB-D9N,10%SDS-PAGE和高效液相色谱检测其纯度。以Vero细胞为靶细胞,进行rSEB-D9N的细胞毒性作用,并计算TCID₅₀值。采用MTT法分别检测不同浓度的rSEB-D9N促人淋巴细胞增殖及抑制KB及MCF-7癌细胞株生长的作用。流式细胞术检测rSEB-D9N刺激人淋巴细胞后CD3、CD4、CD8的表达。结果rSEB-D9N表达产量约占细菌总蛋白30%,纯化后获得纯度为90.48%的rSEB-D9N。rSEB和rSEB-D9N对Vero细胞的TCID₅₀值分别为3.12,8.85μg,10.0,20.0mg·L^-1的rSEB-D9N具有显著的促PBMC增殖的作用(P<0.05),且主要上调CD3,CD4和CD8的表达。5.0～20.0mg·L^-1rSEB-D9N作用的PBMC上清对KB和MCF-7细胞生长均可产生明显抑制作用(P<0.05)。结论获得并纯化了重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白(rSEB-D9N),其细胞毒性作用有所降低,但促人淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用仍较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤相关药物的候选突变体。     

葡萄球菌肠毒素A脂质体不良反应的初步研究

目的：观察葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)脂质体的不良反应。方法：用逆相蒸发法制备SEA脂质体(L-SEA)，静脉注射L-SEA，用ELISA法检测小鼠血浆中细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素(IFN-γ)的水平，并观察L—SEA对新西兰大白兔血压、呼吸及体温的影响。结果：L-SEA组小鼠血浆中细胞因子水平较游离SEA组显著降低，对新西兰大白兔血压、呼吸及体温的影响也明显低于游离SEA组。结论：L-SEA可以显著降低SEA的不良反应，其机制可能是L—SEA能减少血浆中细胞因子的产生。     

仔猪腹泻基因工程疫苗PCR检测方法的建立

以仔猪腹泻基因工程疫苗工程质粒中ＬＴＡ－Ｂ＋变构区为模板，设计了用于该产品检测的一对各长为１８ｂＰ的ＰＣＲ引物和寡核苷酸探针。将菌体直接加热裂解后进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物用琼脂糖凝胶电泳法和同位素标记的寡核苷酸探针杂交检测。研究结果表明，ＰＣＲ－琼酯糖凝胶电泳检测对ＬＴ肠毒汞菌株有良好的特异性，但不能区别野生ＬＴ与改构基因工程ＬＴ肠毒素菌株。用对工程菌特异性探针杂交能将工程菌与食野生ＬＴ肠毒素菌株区别出来，对仔猪腹泻基因工程疫苗具有高度的特异性和敏感性，可检出１ＣＦＵ工程菌。该方法的建立为进一步研究这种基因工程产品的生态环境影响提供了方法学基础。