几乎全长的CRISP90基因的扩增与克隆

以自行设计合成的一对引物（＃Ｐ５／＃７３１），应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ），从基因组ＤＮＡ中扩增了编码９０ＫＤａ的变异性表面特异蛋白的几乎全长的基因。ＰＣＲ产物被克隆到质粒中，并通过双脱氧链终止法将插入的基因片段进行了序列分析，推导出的氨基酸序列半胱氨酸含量为１１．８ｍｏｌ％，而且多数的半胱氨酸是以ＣＸＸＣ基序重复出现２６次，序列分析发现有２个天冬酰胺连接的糖基位点。基因序列显示出一个２０１９ｂｐ长的开放阅读框架。同源性比较发现它与编码７２ＫＤａ人的兰氏贾第鞭毛虫虫株的变异性表面蛋白基因，有相当强的同源性     

人神经生长因子在CHO细胞中的高效稳定表达

神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)是神经系统重要的营养因子[1 ] 。NGF的主要生物学效应是维持外周交感、感觉神经元和中枢胆碱能神经元的存活和发育 ,促进神经系统损伤后修复 ,同时还参与调节免疫和造血等非神经系统的功能[2 ] 。NGF在治疗神经损伤、早老性痴呆和外周神经病等方面具有广阔的临床应用前景[3] 。基因工程方法是获得人神经生长因子 (hNGF)的重要手段之一 ,大肠杆菌表达的hNGF ,其体外折叠困难 ,复性后的蛋白生物比活性低。而在哺乳动物细胞中可产生具有较高生物学活性的类似天然蛋白的人神经生长因子。国内尚未有h…     

人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇的基因克隆与序列分析

应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ＿ＰＣＲ）方法快速克隆人甲状腺过氧化物酶（ｈＴＰＯ）抗原决定簇基因１７０２～２６２２（编号相对于起始密码，编码ＡＡ５６８～ＡＡ８７４）。将此片段重组入ＰＵＣ１８质粒，并用ＰＣＲ＿双链ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）方法测定全部顺序。结果表明确实克隆到ｈＴＰＯ（１７０２～２６２２）区的基因片段，有两个单碱基，但未造成编码氨基酸改变     

改良消减杂交法在多种肿瘤细胞凋亡相关基因克隆中的应用

目的　应用基于聚合酶链反应 (PCR)技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤凋亡相关基因。方法　以全反式维甲酸 (ATRA ,1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡 ,在此基础上 ,采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤细胞凋亡相关基因。结果　在维甲酸 ( 1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡过程中 ,有肿瘤坏死因子、泛素、热休克蛋白和C erbB 2基因参与 ,并成功克隆出 3条可能与凋亡密切相关的未知基因 ,均被GenBank收录 ,登录号为AF174394、AF14 4 0 5 6、AF14 1882。结论　这种基于PCR技术的改良消减杂交方法对于差异表达基因的克隆是十分有效的。     

人细胞色素P4502C9cDNA的克隆,鉴定及真核细胞表达重组质粒的构建

从人肝组织中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增人细胞色素Ｐ４５０２ＣＯ的ｃＤＮＡ。     

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。     

突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达

目的：通过基因工程的方法将ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ基因改造以得到更加稳定的酶。方法：以本实验室构建的 ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ为模板,利用含有突变核苷酸的引物进行 ＰＣＲ扩增,将正确测定的含 ｒｈＣｕ, Ｚｎ－ＳＯＤ突变（ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ）基因的重组质粒重组到表达载体ＰＥＴ－２２ｂ（＋）中,重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ。结果：表达产物占菌体总蛋白的３８％,具有特异性ＳＯＤ酶活性。结论：从基因突变的角度改善酶的性能不仅具有理论意义,又有一定的实用价值。     

P185erbB2单抗可变区基因克隆及人鼠嵌合抗体真核高效表达载体构建

P185是erbB_2(HER2/neu)基因编码的具酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达,且与肿瘤的耐药、转移、复发有关.应用P185单抗进行肿瘤的诊断和判断预后已得到广泛应用,美国FDA已批准一株人化抗体应用于临床治疗erbB_2高表达的乳腺癌,但国内尚无人化抗体应用于临床治疗.为获得具有临床治疗价值的人化抗体,消除HAMA反应,本文从自制的10株抗P185胞外区的单抗中选出抑制erbB_2高表达的肿瘤细胞增殖活性最高的一株(C25)进行人化改造.C25单抗在体外对SKBR3细胞增殖的仰制率可达60.63%,属于小鼠IgG1亚类、к轻链.根据C25的IgG亚类选用Winter等设计的引物,以BT-PCR方法从杂交瘤细胞株中扩增轻、重链可变区基因.分别克隆     

阳春砂基于转录组的萜类合酶基因挖掘及一个单萜合酶基因的克隆

【目的】深入挖掘阳春砂转录组中挥发性萜类合酶相关基因,为全面认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控模式奠定基础。【方法】整理前期工作获得的阳春砂2个转录组的数据,筛选已注释的及利用本地blast方法再注释的萜类合成途径的unigene;并通过对部分候选unigene的表达量与挥发性萜类化合物含量的相关性分析及生物信息学分析,进一步筛选出相关基因;采用PCR及重组载体构建的方法克隆其中一个单萜合酶基因,并对其编码蛋白序列进行分析。【结果】筛选得到10个挥发性萜类合成上游途径相关unigene及11个下游萜类合酶基因;相关性分析证明候选基因与阳春砂主要挥发性萜类有较强相关性;并成功克隆得到Av TPS1基因,其序列包含1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸;其编码蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序,N端含有一段叶绿体转运肽;系统进化分析表明Av TPS1属于TPS-b亚家族。【结论】结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂多个值得后续研究的萜类合酶基因;其中对Av TPS1的克隆及生物信息学分析为后续功能鉴定提供了基础。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。