深低温保存人角膜内皮细胞复苏培养观察

作者采用自控程序降温机对角膜内皮细胞进行超低温冷冻方法保存,并对复温后的角膜内皮细胞进行培养观察,研究超低温长期保存角膜内皮细胞的可行性.     

不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存的影响

背景:胚胎干细胞的长期低温贮存成为胚胎干细胞研究和应用的重要环节。传统的低温贮存保护剂主要包含二亚基亚砜、甘油、动物血清等,对于许多细胞类型并不能有效保证细胞的存活率,甚至于损失了细胞的某些功能。目的:开发适用于小鼠胚胎干细胞的低温贮存试剂。设计:观察实验。单位:广州医学院从化学院生理教研室与科宇联合干细胞生物技术有限公司。材料:实验于2004-10/2005-09在科宇公司实验室完成。小鼠细胞系mES-1为军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室惠赠。方法:将mES-1维持培养收集的细胞低温贮存。实验以二亚基亚砜为主要的低温贮存保护剂。按低温保护液成分不同分4组:对照组低温保护液包含DMEM(高糖)、10%二亚基亚砜、10%胎牛血清、10mg/mL抗坏血酸、0.18mg/mL肌醇、0.44mg/mL叶酸,甘露糖组在对照组的基础上补充7.56mg/mL甘露糖,海藻糖组补充34.23mg/mL海藻糖,蔗糖组补充41.94mg/mL蔗糖。观察不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存后存活率和多向分化能力的影响。主要观察指标:胚胎干细胞集落形成率和拟胚体形成率。结果:①冻存后各低温保存剂组的胚胎干细胞集落形成率均比冻存前有显著性降低[对照组:(24.0±8.8)%,甘露糖组:(42.0±10.1)%,海藻糖组:(84.0±8.2)%,蔗糖组:(70.0±14.2)%,冻存前:(95.0±4.7)%,P均<0.05],其中海藻糖组的胚胎干细胞集落形成率明显高于其他低温保护剂组(P<0.05)。②海藻糖组的拟胚体形成率高于对照组和甘露糖组[(90.0±5.2)%,(80.0±6.9)%,(82.0±9.6)%,P均<0.05]。与蔗糖组相比,差异无显著性意义。结论:以海藻糖为核心低温保护剂成分可有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力。     

家兔同种异体管道深低温保存的实验研究

目的 :从功能代谢角度评价深低温保存生物管道的实际效果 ,观察冷冻保存对同种动脉活性的影响。方法 :主动脉取自空气栓塞处死兔子 ,修剪后程控降温 ,液氮长期保存。复温后光镜检查 ,体外培养检测糖消耗量 ,同时采用组织块贴壁法进行原代细胞培养检测细胞生长活性。结果 :动脉解冻后弹性纤维结构基本完整 ,有轻度水肿和黏膜变性 ,动脉壁结构大致正常 ;体外培养葡萄糖消耗量平均大于 16mg·dL-1·2 4h-1;复温后材料有生长和代谢活性。结论 :表明同种动脉低温保存技术已经达到比较理想的要求 ,可为临床应用提供相关的实验依据。     

脐血造血干细胞低温保存方法的探讨

目的 探讨脐血造血细胞的低温保存方法。方法 分别用程控降温液氮保存法、非程控降温液氮保存法和-80℃非程控降温保存法保存脐血有核细胞。结果 3种方法保存脐血有核细胞均获得较满意的结果。结论 用羟乙基淀(HES)自然沉淀法和低速离心法分离脐血有核细胞，获得较满意的回收率；用-80℃非程控降温保存法保存脐血有核细胞，可降低二甲基亚砜(DMSO)对细胞的毒性作用，适用于短期保存造血细胞。     

最适苦参碱浓度并用冻存保护剂对L-02人肝细胞系冻存保护的效应

目的:观察不同浓度剂量苦参碱与冻存保护剂联用对L-02人肝细胞系液氮冻存复苏后功能的影响,探索一种适合肝细胞保存的新方法。方法:实验于2005-01/07在南方医科大学中心实验室进行。常规培养的L-02人细胞系用胰酶消化后,将收集的L-02人肝细胞系分别以6种不同的冻存液(10%二甲基亚砜、5%二甲基亚砜 0mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 0.2mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 2mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 10mg/L苦参碱)在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏L-02人肝细胞系,进行存活率、形态学及功能检测。结果:①复苏后L-02人肝细胞系的活存率5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组明显高于其他处理组[胰酶刚消化的细胞活率为(96.2±1.4)%,10%二甲基亚砜组(76.6±3.8)%,5%二甲基亚砜组(81.9±2.4)%,5%二甲基亚砜 0.2mg/L苦参碱组(81.6±2.4)%,5%二甲基亚砜 2mg/L苦参碱组(84.7±2.8)%,5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组(89.6±3.4)%,5%二甲基亚砜 10mg/L苦参碱组(86.9±1.6)%,P>0.05]。②复苏后5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组肝细胞完整性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,与未冻存组肝细胞形态相似。③复苏后L-02人肝细胞系培养上清液尿素含量、上清液白蛋白含量5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组明显高于其他处理组,与对照组无显著差异。结论:①苦参碱对L-02人肝细胞液氮冻存有保护作用,6mg/L苦参碱是最好的浓度。②苦参碱、二甲基亚砜有协同作用,5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱联合冻存保护体系显著提高L-02人肝细胞系的冻存质量。     

深低温冷藏并戊二醛化同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点评价

背景：采用不同方法处理的异体肌腱移植修复手外伤肌腱缺损，已成为近年手部组织工程研究的重点。目的：探讨经深低温冰箱冷藏及戊二醛处理的同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点。设计：自身前后对照观察。单位：惠州市中心人民医院骨科病房。对象：选择1997—01／2001—08在惠州市中心人民医院骨科二病区住院的男性手外伤肌腱缺损患者15例（17条肌腱），年龄20～35岁。其中伸指肌腱缺损8条，屈指肌腱缺损9条；缺损肌腱长3-9cm。方法：应用从健康青壮年意外死亡者志愿贡献或外伤断肢后无再植条件废弃肢体经无菌操作条件取出的手指屈肌腱（本人或家属均知情同意），经-80℃深低温冰箱保存，术前应用3．5g/L戊二醛溶液浸泡后按显微外科缝合肌腱的方法将异体肌腱移植于手部肌腱缺损处。随访时按国际手外科联合会制定的总活动度法评定疗效，分为优、良、可、差4级。主要观察指标：手指总主动活动度和排斥反应。结果：15例患者（17条肌腱）均进入结果分析。随访8个月，手指肌腱总活动度优级4条，良级6条，可级4条，差级3条，总有效率82．36％（14／17）。全部病例没有使用激素及免疫抑制剂，均没有发生急性免疫排斥反应，移植的肌腱无断裂。结论：异体肌腱经-80℃深低温保存及术前应用戊二醛处理，可以降低移植后的抗原反应，增加移植肌腱的强度和韧性，避免可能发生的传染病的感染，是代替自体肌腱移植的良好方法之一，但移植后存在着肌腱粘连的并发症尚需解决。     

骨组织低温保存技术的特点

工程组织和生物活体器官的低温保存是当今生物医学工程最前沿的研究课题。组织较细胞结构更为复杂,传热传质难以控制。细胞与材料的黏附是影响骨组织成功保存的重要因素,玻璃化低温保存是实现骨组织成功保存的重要方法,另外还应积极寻找其他能够有利低温保存的外界因素,如压力,微波等。到目前为止,器官的低温保存没有取得大的突破,但相信,随着科学实验和技术的发展,研究各类细胞、组织、器官的低温耐受性和生物材料传热规律的成熟,寻找减轻损伤的技术,最终会实现器官的低温保存。     

深低温保存新鲜富含血小板血浆质量分析

为了评价批量制备的深低温保存富含血小板血浆(cryo-FPRP)的效率和效果,在优化建立的无偿献血者血小板的批量分离和制备cryo-FPRP过程中测定了ACD抗凝的200ml全血、FPRP、含5%DMSO的FPRP(DM-SO-PRP)和-80℃冰箱然冰冻保存后复温的FPRP(Cryo-FPRP)的血小板计数(Plt)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血浆内pH、血浆乳酸(LA)浓度和乳酸脱氢酶(LDH)浓度、细菌培养、血小板CD62p阳性率、PAC-1阳性率及抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度,也测定了FPRP和cryo-FPRP的促凝血活性.结果表明①血小板的总平均得率为70%;FPRP中残余的红细胞≤1×109/袋;白细胞≤1×107/袋.②血浆pH、LA浓度和PAC-1阳性率在整个制备和保存过程中没有明显变化.③血浆内LDH、血小板CD62p阳性率和血小板抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度在血小板冰冻保存后出现明显升高.④与FPRP比较,cryo-FPRP诱导的血浆凝固时间明显缩短.结论①本研究选择的离心分离制备FPRP条件可高效分离无偿献血者的血小板,同时不会导致血小板激活率增加.②深低温保存无偿献血者的新鲜富含血小板血浆可有效防止代谢产物的积累和pH下降,并且可以高效预防血小板GPⅡb/Ⅲa的激活.③冰冻保存后部分血小板胞膜受到明显损害.④血小板胞膜表面GpIb-Ⅸ-Ⅴ复合物的数量增加,促凝血活性明显增强.     

肌腱玻璃化法冷冻保存的体外实验

目的:目前临床上常用低温冷冻法来保存同种异体肌腱,但操作较复杂费时,并且所保存的肌腱活性较低而限制其应用。采用已筛选的玻璃化法冷冻保存鸡屈趾深肌腱,并将复温后的玻璃化肌腱进行体外检测,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成。①实验材料及分组:来亨鸡16只,雄性,体质量2.5kg左右,随机分为2组,玻璃化组为玻璃化肌腱,新鲜肌腱组为新鲜肌腱,每组8只。②实验过程:切取来亨鸡屈趾深肌腱,置入玻璃化液内快速投入液氮保存2周制备玻璃化肌腱。③实验评估:将2组肌腱在体外进行大体、组织学及超微结构观察,羟脯氨酸含量测定,生物力学性能检测,并对两组肌腱进行细胞培养与鉴定。结果:①玻璃化组肌腱的大体、组织学及超微结构与新鲜肌腱组相似,其细胞及细胞外结构得以良好保存。②应用碱解法测定玻璃化肌腱内的羟脯氨酸含量为69.27mg/g,与新鲜肌腱组间差异无统计学意义。③玻璃化组肌腱破裂强度为165.58MPa,弹性模量1.41GPa,与新鲜肌腱组的力学性能差异无统计学意义。④将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,其生物学特性与新鲜肌腱组相似。⑤将两组肌腱培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞。结论:玻璃化法保存的肌腱具有良好的细胞活性、细胞外结构及力学性能,其生物学及生物力学特性无明显变异。     

依达拉奉对深低温保存大鼠断肢再植后缺血再灌注损伤的影响

目的:观察依达拉奉对深低温保存大鼠断肢再植后出现缺血再灌注损伤时的保护作用。方法:实验于2006-04/11在山东省立医院手足外科低温医学实验室完成。①选取健康成年Wistar大鼠36只,随机分为对照组、冷冻组和依达拉奉组3组,每组12只。②对照组只显露股动静脉而不结扎,其他2组大鼠截断右后肢,对断肢进行深低温冷冻保存处理(自结扎股动静脉至深低温保存约2h)。③1个月后,将冷冻保存的断肢复温、灌洗液洗脱,依达拉奉组所用灌洗液中含依达拉奉0.5mg/kg,行自体肢体回植(自液氮中取出肢体至恢复血供约2h),恢复肢体血供4h后取材,骨骼肌丙二醛含量,超氧化物歧化酶活性以及线粒体ATP酶活性,测定胫前肌含水量,光镜观察各组骨骼肌肌组织的结构改变。结果:36只全部进入结果分析。①骨骼肌丙二醛含量:依达拉奉组低于冷冻组[(10.37±1.25),(15.36±1.28)μmol/g,P<0.01]。②骨骼肌ATP酶和超氧化物歧化酶活性:依达拉奉组高于冷冻组[(206.2±45.2),(72.7±32.5)μkat/g;(83.9±5.2),(70.5±8.0)mkat/g;P均<0.01]。③胫前肌湿/干质量比值:依达拉奉组低于冷冻组(4.89±0.82,6.38±0.63,P<0.01)。④光镜结果显示依达拉奉组骨骼肌损伤程度明显轻于冷冻组。结论:依达拉奉可以降低肢体再灌注后肌肉组织中的氧自由基水平,减轻缺血再灌注对骨骼肌造成的损伤,对缺血再灌注骨骼肌具有保护作用。