转染结缔组织生长因子基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变

目的观察大鼠肾系膜细胞（MsC）转染结缔组织生长因子（CTGF）基因转染阳性细胞克隆中纤连蛋白（FN）和Ⅳ型胶原（ColⅣ）表达的改变,探讨CTGF在肾小球硬化发生中的作用。方法经脂质体介导将含有CTGF的重组表达质粒转染至大鼠MsC,用G418筛选及Western blot和半定量逆转录聚合酶链反应作鉴定;检测阳性克隆FN、ColⅣ蛋白及其mRNA表达的改变。结果成功建立高表达CTGF的阳性MsC克隆（MCT-1,2）,并证实其与对照组相比,阳性MsC克隆FN、ColⅣ的表达均有上调,其FN蛋白及其mRNA表达分别增高2．9倍和3．2倍,ColⅣ蛋白和mRNA表达分别增高为2．4倍和3．8倍。结论CTGF可促进MsC的FN、ColⅣ的表达。表明其在肾小球硬化发生中起促进作用。     

聚乙烯亚胺-胆固醇结合脂质微泡介导的基因转染系统

本文研究了聚乙烯亚胺-胆固醇阳离子聚合物(PEI-Chol)基因载体的性能及其结合中性脂质、聚乙二醇修饰脂质微泡介导的基因传递系统(微泡/PEI-Chol/DNA)的体外细胞基因转染效率。采用胆固醇甲酰氯与聚乙烯亚胺(Mw1800)通过酰胺化制得PEI-Chol,并运用IR、1H NMR和MADI-TOF-MS(基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱)对其结构和分子量进行测定,平均相对分子质量约为2000。采用反相挥发法制备DPPC、DSPE-PEG2000和全氟丙烷构建的粒径为2～8μm的脂质微泡,并运用自组装技术将PEI-Chol/DNA复合物与微泡融合,构建微泡/PEI-Chol/DNA(bubble/PEI-Chol/DNA)基因转染系统;以pEGFP-Cl(enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白)为报告基因,用凝胶滞留试验考察PEI-Chol的DNA压缩能力,同时在A549和MCF-7两种细胞中比较以PEI-Chol为核心构建的各种载体系统的细胞毒性、抗血清沉淀作用以及细胞转染效率。结果发现,当N/P比值为4以上时,PEI-Chol能有效压缩DNA;...     

阳离子脂质体用做基因传递载体的研究进展

 基因治疗的难题之一在于研制安全有效的基因传递载体。常用的基因传递载体分为病毒载体和非病毒载体两类,其中,非病毒载体中的阳离子脂质体因具有低毒性与免疫原性、生物相容性好、易于制备等优点而受到广泛关注,具有良好的应用前景。近年来对阳离子脂质体载体的研究主要集中在对其传递基因机制的考察、各种影响其转基因效率的因素的探求、应用各种方法研制安全性和转染活性更佳的新型阳离子脂质体等方面。文中从转基因特点、传递机制、常用的制备材料、影响转基因效率的因素、近年来出现的新型阳离子脂质体等方面综述了此类基因传递载体的研究进展。     

纳米粒子PLGA介导HIF-1α基因转染的实验研究

目的 研究纳米粒子PLGA携带特异性HIF-1α基因转染的可行性及其效率.方法 构建HIF-lα基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)的重组体.应用复乳溶剂挥发法制备pcDNA3.1(+)-HIF-1α的PLGA纳米粒,用正交设计法对纳米粒子的制备工艺进行优化,检测其包埋率、体外释放情况及粒度.观察纳米粒的形态、大小和粒度,研究体外释药特性、抗核酸酶降解性能.用PLGA-pcDNA3.1(+)-HIF-1α纳米粒转染U251细胞,Western blot检测PLGA纳米粒子中HIF-1α蛋白表达.结果 用正交设计法优化制备工艺成功构建pcDNAB.1(+)-HIF-1α的PICA纳米粒,形态圆整,大小均匀,平均粒径102 nm,含药量0.83%,包封率可达72%,有对抗核酸酶降解能力,体外释药缓慢.PLGA-pcDNA3.1(+)-HIF-1α纳米粒可持续高效表达HIF-1α蛋白.结论 PLGA-pcDNA3.1(+)-HIF-1α纳米粒可用于特异性基因的转染.     

荧光蛋白Venus载体构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建黄色荧光蛋白Venus重组载体,并观察其在哺乳动物细胞中表达情况.方法 将Venus克隆至限制性内切酶处理的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,转染293T细胞,荧光显微镜下观察结果.48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术印证荧光蛋白Venus表达情况.结果 重组载体经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T细胞后可见明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明荧光蛋白Venus高量表达.结论 成功构建了Venus重组载体,荧光蛋白Venus在哺乳动物细胞中高表达,此为分子与细胞生物学提供了一种重要的研究工具.     

HepG2细胞电转染条件的优化

目的优化HepG2细胞电转染条件,进一步提高HepG2细胞的转染效率。方法采用电穿孔方法将pcDNA3．1-EGFP导入HepG2细胞中,在500μL电转染体系中,在不同电场强度、细胞数目、脉冲频率、脉冲时间、电转质粒数目、电转缓冲液、培养基血清浓度条件下,分别将pcDNA3．1-EGFP质粒电转染HepG2细胞,检测不同条件下细胞存活率和转染率。结果电转前4℃孵育电转体系混合液10min,方波电转条件在1个电脉冲、电压270V、细胞数为2×10^6个、质粒20μg、脉冲时间20ms、电转缓冲液为优化缓冲液、电转后置于37℃、含15％FBS的DMEM高糖培养基中培养48h,可获得高转染率（60．68±1．87）％。结论优化电穿孔法的电转染条件能够有效提高HepG2细胞的电转染效率。本研究为外源基因电转染HepG2细胞提供了可靠的试验参数。     

半乳糖凝集素1表达下调对食管鳞癌细胞增殖的影响

目的探索半乳糖凝集素1(Galectin-1)表达下调对食管鳞癌细胞增殖的影响。方法利用细胞转染技术将Galectin-1 siRNA和对照siRNA转染到食管鳞癌EC9706细胞中,细胞分为三组,即未处理组、对照siRNA组和Galectin-1 siRNA组,利用RT-PCR、Western印迹分析Galectin-1基因和蛋白的变化;利用CCK-8试剂盒检测下调Galectin-1的表达对细胞增殖的影响。结果 Galectin-1 siRNA组与未处理组和对照siRNA组相比,Galectin-1 mRNA及蛋白表达明显降低。Galectin-1 siRNA组中的EC9706细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)。结论转染Galectin-1 siRNA后能明显下调食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达;Galectin-1表达的下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖。     

寡肽阳离子脂质体作为基因载体的体外研究

采用阳离子寡肽脂质材料赖氨酰化谷氨酸双十四醇酯(T2GL)制备阳离子脂质体(CL),与增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)静电结合形成复合物(CL/pDNA),CL/pDNA粒径和表面电位分别为(132.3±1.0)nm和+(31.35±2.99)mV。考察CL/pDNA对肝素及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)的稳定性,结果表明,CL/pDNA可被适宜浓度的肝素竞争性解组装释放pDNA,其对DNase I的稳定性明显优于市售制剂Lipofectamine 2000。研究CL与pDNA的比例(N/P)及质粒用量对转染效率的影响,结果显示当N/P为3,质粒用量4μg时,CL/pDNA的转染效率最佳。采用CL/pDNA对3种不同的细胞进行转染,发现CL/pDNA在人源非小细胞肺癌A549细胞中转染效果最好,与Lipofectamine 2000相比,转染效率相当但细胞毒性更低,因此为进一步研究其体内行为提供了良好的基础。     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

哺乳动物细胞转染技术概述

本文介绍了三大类哺乳动物细胞转染方法,并概述了这些方法的应用及其优缺点。