抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用

目的探索大规模制备抗日本血吸虫单克隆抗体的新途径。方法以日本血吸虫感染小鼠的脾细胞为源,构建抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并对该抗体库进行了富集、筛选和鉴定。同时,用从抗体库制备的可溶性单链抗体对病人血清进行了检测。结果构建的噬菌体抗体库库容为1.07×106cfu。筛选获得2个特异性阳性克隆。这两株克隆表达的单链抗体用于血吸虫病人血清检测的结果为:(1)以其中一株单链抗体检测急性病人的敏感度为60%,检测慢性病人的敏感度为36.7%,特异度为90%。(2)将两株单链抗体混合后检测急性病人的敏感度为75%,检测慢性病人的敏感度为56.7%,特异度为85%。结论首次成功地构建了抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并从中筛选制备了能有效检测血吸虫病患者血样中的循环抗原的单链抗体。     

建立BSAS—ELISA检测日本血吸虫循环抗原的研究

目的建立BSAS－ELISA技术以提高检测日本血吸虫循环抗原的敏感性。方法在夹心ELISA的基础上，引入高度放大的生物素一链霉亲和素系统（BSAS），建立BSAS－ELISA基本检测技术及其改良的二步法。结果应用单抗3D10以该技术的基本法与二步法检测感染兔血清，检出率可达90．00％；用单抗MG2以二步法经盲法检测，慢性血吸虫病患者的检出率达86．00％，3D10对正常人的假阳性率为4．76％，MGZ为33．33％。结论BSAS－ELISA检测日本血吸虫循环抗原可提高其敏感性。本实验所用二种单抗的特异性不甚理想，进一步提高敏感性及改进特异性的关键在于筛选出更理想的单抗。     

Infection with Schistosoma mansoni prevents insulin dependent diabetes mellitus in non-obese diabetic mice

The spontaneous development of insulin dependent diabetes mellitus in non-obese diabetic (NOD) mice has been shown to be mediated by a Th1 response against beta cell antigens. It is known that in murine models of Schistosoma mansoni infection, egg production is associated with a switch from a Th1 to Th2 response. This subsequent dominance of a Th2 response in S.mansoni infected mice has been shown to influence the response to other infectious agents or antigens. We therefore determined whether infection with S.mansoni could influence the spontaneous incidence of insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) in NOD mice. Infection with this helminth significantly reduced the spontaneous incidence of IDDM. IDDM was also prevented by injecting parasite eggs alone. Because until relatively recently humans might expect to succumb to a variety of infectious agents, the current freedom from infection might permit the expression of a genetic predisposition to autoimmune pathology and be responsible for the increased incidence of IDDM.     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

The Th1 to Th2 shift induced by Schistosoma mansoni does not exacerbate murine aids (MAIDS)

Schistosoma mansoni infection in mice is associated with a switch from a Th1 to a Th2-type cytokine response. The role of Th1 and Th2 responses in immune dysregulations associated with AIDS and murine AIDS (MAIDS) is controversial, but a Th2 bias could be associated with disease progression, raising the hypothesis that helminth infections might accelerate the retroviral disease progression. Here, we used the murine model of AIDS to evaluate the course of the viral disease during co-infection with S. mansoni . C57BL/6 mice were infected with S. mansoni cercariae 8 weeks before intravenous challenge with the LP-BM5 retroviral complex. MAIDS did not progress faster in co-infected mice, in terms of spleen and inguinal lymphadenopathy size, ecotropic virus titres in the spleen, or in vitro proliferative responses to mitogen. Th2 cytokine production was not enhanced in co-infected animals, except for an isolated increase in IL-4 production 21 weeks after LP-BM5 infection. Co-infected animals had significantly lower lymph node and spleen weights than mice infected with LP-BM5 only. MAIDS did not influence the granulomatous response to S. mansoni in the liver of co-infected mice. Finally, infection with S. mansoni neither enhanced Th2 cytokine production nor accelerated MAIDS progression in animals subsequently challenged with LP-BM5 .     

KLH检测日本血吸虫病人血清中特异性IgG和IgG4考核疗效的研究

用KLH-ELISA和SEA-ELISA分别检测日本血吸虫病人治疗前IgG及治疗后不同时期血清中特异性IgG和IgG4.结果表明:两种方法在敏感性和特异性方面差异无显著性(P>0.05);用KLH检测治疗后12个月血清中IgG及IgG4的阴转率均显著高于SEA者;KLH检测治疗后24个月血清中IgG阴转率为92.9%,IgG4阴转率为97.6%.提示KLH检测特异性IgG和IgG4具有较高的诊断价值和疗效考核价值;特异性IgG4可能系一疗效敏感抗体,可望作为疗效评价指标.     

日本血吸虫成虫对嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的体内趋化作用

应用体内试验将分离制备的日本血吸虫成虫分泌排泄物和浸出液注入健康豚鼠背部皮内，１～４８ｈ取其组织观察嗜酸酸性粒细胞和中性粒细胞数量。在注射后２～４ｈ，注射部位可见少量嗜性粒细胞，８ｈ细胞数量达高峰，然后减少，２４ｈ后只见少量嗜酸性粒细胞。在注射后１ｈ，注射部位中性粒细胞增多，４ｈ细胞数量最多，然后逐渐减少，４８ｈ降至最低。结果证明日本血吸虫成虫对嗜酸性粒细胞和中性粒细胞有明显的趋化作用。     

中国大陆日本血吸虫随机扩增多态DNA(RAPD)的初步研究

目的对中国大陆浙江、安徽、江西、湖北、湖南、四川、云南7省日本血吸虫种群进行遗传变异研究。方法应用随机扩增多态DNA（RAPD）技术，对5条寡核苷酸随机引物扩增。结果获得32条DNA片断，17个基因位点，长度在100bp～2600bp之间。各种群多态百分率（P）为52．9～70．6，平均杂合性（H）为0．269～0．363。中国大陆湖区日本血吸虫各种群间遗传距离（D）为0．000～0．023．山区种群间为0．155，湖区种群与山区种群间遗传距离为0．036～0．139。同时，P235-930bp，P293－910bP分别为四川种群和云南种群特异性DNA片断，P256－720bp为日本血吸虫雌虫特异性DNA片断。对中国大陆日本血吸虫虫株复合性和系统发生作简要讨论。     

日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon 亚型基因的表达及鉴定

目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合成 1对引物 ,以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板 ,用RT PCR法合成日本血吸虫大陆株 14 3 3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK Sj14 3 3 ,转染到大肠杆菌BL2 1,双酶切鉴定后 ,通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL2 1中进行表达及Western blot鉴定。　结果　RT PCR产物、pGEM T Sj14 3 3及pBK Sj14 3 3分别经双酶切均获得一特异性基因片段 ,其表达产物经SDS PAGE及Western blot鉴定后其分子质量为 3 2ku ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。　结论真核表达重组质粒 pBK Sj14 3 3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为 3 2ku融合蛋白 ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。     

体外日本血吸虫卵肉芽肿反应动力学的进一步观察

目的 进一步观察体外日本血吸虫卵肉芽肿反应模型的形态变化及反应强度与脾细胞供鼠感染阶段的关系。方法 取日本血吸虫感染后不同阶段的小鼠脾细胞在体外培养,在培养系统中定量加入日本血吸虫干卵后,对围绕虫卵的脾细胞反应进行形态学观察和计数。结果 感染鼠脾细胞出现显著的围绕虫卵的黏附反应,黏附细胞最初以粒细胞为主,很快被巨噬细胞所替代,周围有淋巴细胞的增生反应,以后出现成纤维细胞;加卵培养后感染鼠脾细胞的肉芽肿反应指数高于对照组(P<0.01或<0.05);感染后7—20周的感染组小鼠脾细胞对虫卵的反应指数也均高于对照组(P均<0.01)。结论 体外肉芽肿反应具有较好的敏感性和稳定性,可作为研究肉芽肿性炎症反应发生机制的有效手段。