腺病毒载体介导的lacZ基因在NG细胞系及大鼠黑质的表达

本实验用标记基因ｌａｃＺ５型重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ）转染培养的ＮＧ细胞系，Ｘ－ｇａｌ染色检测转染效率．在培养的ＮＧ细胞系，当病毒滴度为２×１０８时，转集率达到５０％，当滴度为２×１０９时，转染率达１００％，有较好的量效关系；固定病毒液度为１０１０，培养２～１６ｈ，细胞的转染率随时间延长而提高，有较好的时效关系。将Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ注射到大鼠黑质部位后，分别于注射后３～１２０ｄ取脑、切片、Ｘ－ｇａｌ染色，发现黑质局部从第７ｄ开始有部分蓝染，第１０ｄ达高峰，注射局部感染率１００％；９０ｄ时开始下降，持续至１２０ｄ；纹状体等其它部位无蓝染．上述结果提示，腺病毒载体介导的标记基因可在培养的神经细胞系和中脑黑质部位高效表达，为进一步开展中枢神经系统退变性疾病尤其是帕金森氏病的基因治疗奠定基础。     

腺病毒载体介导bcl-2基因转染在离体和在体状态下对损伤运动神经元的保护作用

本文目的在于观察携带 bcl-2基因的重组腺病毒 (Ad/ s-bcl-2 )在离体和在体条件下对损伤运动神经元的保护作用。采用培养脊髓运动神经元的谷氨酸损伤模型和大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,评价重组 bcl-2腺病毒对损伤运动神经元的影响。指标是bcl-2原位杂交和免疫组化反应、台盼蓝拒染法检测培养神经元存活、TU NEL 阳性神经元计数以及脊髓运动神经元 ACh E反应。结果 :(1) Ad/ s-bcl-2可转染离体和在体脊髓运动神经元并使其过表达 bcl-2。 (2 )过表达 bcl-2可延长培养神经元的生存时间。(3 )过表达 bcl-2可显著地减少谷氨酸诱导的原代培养脊髓运动神经元的凋亡以及坐骨神经切断损伤诱导的脊髓运动神经元的凋亡。 (4 )过表达 bcl-2可显著地缓解坐骨神经损伤诱导的神经元内 ACh E的活性降低 ,并加速其恢复。本研究结果提示 :腺病毒载体中介 bcl-2基因转染对离体和在体损伤的运动神经元均具有保护作用     

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18 L1－E6，L1－E7嵌合基因的表达载体，并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV18 L1－E6和L1－E7基因，插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法，突变L1－E6，L1－E7基因序列中与转化作用相关的位点，分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX-1L1 E6Mxx,L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法，转染CHO细胞，以抗HPV－18L1，抗E6和抗E7特异性单克隆抗体（mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示，转染各种pVAX1-LIE6Mxx-L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P－N值均＞2．1；免疫细胞化学检测，在胞浆，胞核可见棕黄色颗粒。结论 我建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白质表达质粒，可在转当细胞内表达相应的L1－E6Mxx和L1－E7Mxx蛋白，为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。     

Genotoxicity of naturally occurring indole compounds: correlation between covalent DNA binding and other genotoxicity tests

3-Methylindole (3MI), melatonin (Mel), serotonin (Ser), and tryptamine (Tryp) were evaluated in vitro for their potential to induce DNA adducts, DNA strand breaks, chromosomal aberrations (Abs), inhibition of DNA synthesis, and mutations. All compounds produced DNA adducts in calf thymus DNA in the presence of rat liver S9. In cultured rat hepatocytes, all produced DNA adducts but none induced DNA strand breaks. In Chinese hamster ovary cells, 3MI and Mel produced DNA adducts, Abs, and inhibition of DNA synthesis with and without S9, except that Mel without S9 did not form adducts. Ser formed DNA adducts, was an equivocal Abs inducer, and suppressed DNA synthesis. Tryp induced neither adducts nor Abs, but did suppress DNA synthesis with S9. Ser and Tryp were less cytotoxic than 3MI and Mel. Mel, Ser, and Tryp failed to induce mutations in Salmonella and E. coli strains with or without S9. 3MI and Mel produced DNA adducts but not mutations in Salmonella TA100 with S9. 3MI and its metabolite indole 3-carbinol also did not induce mutations in a shuttle vector system in human cells. The lack of correlation between DNA adducts and other genotoxicity endpoints for these indole compounds may be due to the higher sensitivity of the (32)P-postlabeling adduct assay or it may indicate that the indole-DNA adducts per se are not mutagenic and are not able to induce strand breaks or alkali-labile lesions. The indole-induced Abs may result from cytotoxicity and suppression of DNA synthesis with minimal if any contribution from DNA adducts.     

基于F-score特征选择和支持向量机的P300识别算法

如何从脑电信号中快速准确地识别出P300成分是脑-机接口研究中的一个热点问题.针对P300的识别问题,我们提出了一种将F-score特征选择与支持向量机相结合的判别方法,该方法采用F-score特征选择减少输入特征的维数,以克服支持向量机算法判别速度慢的缺点;然后借助支持向量机算法良好的分类性能实现P300的识别.本文在BCI Competition 2003的P300实验数据集上对该方法进行了验证,结果表明,在5次重复实验中该方法的识别准确率达到了100%,且判别速度与未经特征选择的传统支持向量机算法相比提高了近2倍.     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

肝癌特异性超抗原SEA(D227A)基因表达载体的构建与表达

目的：构建受AFP顺式作用元件调控的超抗原表达载体，将SEA(D227A)特异性的表达于AFP阳性肝癌细胞膜表面。方法：PCR扩增AFP基因启动子、增强子、linker—CD80tm和SEA(D227A)。将上述片断插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，构建AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体(pLXSN SEA(D227A)—linker—CD80tm)。通过脂质体介导，以表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系，用RT—PCR和间接免疫荧光染色，检测SEA的表达。结果：成功地将AFP基因的启动子、增强子、linker—CD80tm和SEA(D227A)克隆到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误，RT—PCR和间接免疫荧光法检测证实，SEA(D227A)能在AFP阳性的肝癌细胞膜特异性表达。结论：AFP顺式作用元件修饰的超抗原表达载体的构建，为下一步用其强化肝癌的免疫治疗奠定了基础。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的Id2真核表达载体构建

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体，为骨骼肌的组织工程研究提供有效的分子工具。方法：利用RT-PCR的方法扩增出Id2全长cDNA，利用T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接，构建克隆载体，经限制性内切酶EcoR1酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGF-C2真核表达载体，构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2，经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性；并通过细胞转染技术将Id2基因导入L6成肌细胞中。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段，获取了转染外源性Id2基因的L6细胞。结论：我们成功构建了同时携带有G418筛选位点和增强绿色荧光蛋白的Id2真核表达载体？     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础