丙型肝炎病毒基因免疫重组真核表达质粒构建的初步研究

目的:利用真核表达载体pCDNA3.1(+)与HCV核心区基因重组,为进一步表达蛋白打基础。方法:首先从1例HCV感染者血清中用反转录-PCR法获得全长的核心区基因并测序,继而将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建重组体。结果:HCV核心区基因为HCV型,将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,分子量为22KD,表达量占菌体蛋白的8.7%。然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建了pCDNAHCVc191和pCD-NAHCVc-hIL2两种重组体。结论:pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体,尤其后者是核心区基因与人白介素-2基因融合,可引发更好的基因免疫效果。上述工作奠定了整个HCV基因免疫研究的基础。     

含LacZ报告基因的PcDNA3.0裸质粒转染青光眼滤过术后家兔模型的表达

目的:观察含LacZ报告基因的裸pcDNA 3.0重组质粒在体转染小梁切除术后家兔眼的表达情况,建立动物模型,评价其应用价值,为利用裸质粒对抗青光眼术后瘢痕行基因治疗打下基础.方法:制作家兔双眼小梁切除术后模型,采用自身对照,术后1d在右眼术区局部注射含LacZ报告基因的pcD-NA30裸质粒0.1mL(100μg),左眼术区注射等剂量空质粒,通过X-gal染液原位染色检测注射后1,3,6,15d组织标本中报告基因LacZ的表达情况,绘制感染效率曲线.结果:重组pcDNA 3.0裸质粒100μg可以转染术后滤过区结膜下成纤维细胞并表达携带的基因,表达高峰期3～6 d,15d时仍可检测到少量表达细胞,对照侧各个时相点均未检测到表达.结论:重组pcDNA 3.0裸质粒可以携带外源性基因转染家兔小梁切除术后术区成纤维细胞,适用于对青光眼滤过术后动物模型行基因治疗.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

大鼠Smad 7基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的：构建并鉴定大鼠Smad7/pcDNA3.1（＋）真核表达质粒,为进一步研究Smad7的抗肝纤维化作用提供实验基础。方法：TRIzol法抽提大鼠肝组织总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,紫外分光核酸蛋白分析仪测定其浓度与纯度,两步法获取大鼠Smad7cDNA片段,CaCl2法制备感受态细胞,应用EcoRI及XhoI在pcDNA3.1（＋）多克隆位点处进行双酶切,切胶回收载体及目的片段酶切产物,将回收的线性化pcDNA3.1（＋）与Smad7cDNA连接,构建Smad7/pcDNA3.1（＋）重组质粒,转化DH5α大肠杆菌,测序鉴定双酶切证实的阳性克隆。结果：电泳检测RNA的完整性良好,28S约为18S的2倍,A260/A280=1.986,纯度较好,阳性克隆酶切后电泳检测在DNAMarker1.3kb处见Smad7目的片段,5.4kb处见线性化pcDNA3.1（＋）,与预期结果相符,质粒重组成功,并测序证实。结论：大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,为进一步单独或联合其他质粒从TGF-β/SMAD信号传导的不同环节干预肝纤维化提供了实验基础。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.     

Bilayer Films for Mucosal (Genetic) Immunization via the Buccal Route in Rabbits

Purpose. The oral buccal mucosa may be an ideal site for mucosal immunization, allowing for the needle-free administration of cost-effective vaccines. A novel mucoadhesive bilayer film was developed to test the feasibility of this route of immunization in rabbits. Methods. Bilayer films were developed using different ratios of Noveon and Eudragit S-100 as the mucoadhesive layer and a pharmaceutical wax as the impermeable backing layer. Optimal 3/8-inch films were post-loaded with 100 g of plasmid DNA (CMV--gal) or -galactosidase protein. The in vitro release rates and stability of the postloaded antigens were determined. The films were applied to the buccal pouch of rabbits on days 0, 7, and 14, and the humoral and splenocyte proliferative immune responses to -gal were determined through day 28 and compared to those responses after conventional subcutaneous injection of adjuvanted protein. Results. The weight ratio of Noveon and Eudragit S-100 had a significant effect on adhesion time of bilayer films. Postloaded plasmid DNA and -gal remained stable after being released from bilayer films (release of 60-80% in 2 h for both). Buccal immunization using novel bilayer films (109 ± 6-m thickness) containing plasmid DNA led to comparable antigen-specific IgG titer to that of subcutaneous protein injection. All rabbits immunized with plasmid DNA via the buccal route but none by the subcutaneous route with protein antigen demonstrated splenocyte proliferative immune responses. Conclusion. The feasibility of buccal (genetic) immunization with these novel bilayer films was demonstrated.     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。