Taqman MGB探针荧光定量PCR检测HBV DNA含量及YMDD变异的方法学评价

目的评价Taqman MGB探针荧光定量PCR技术检测血清乙型肝炎病毒DNA含量及YMDD变异的方法学特性。方法照美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)制定的评价方案,对该方法HBV DNA定量的线性范围、精密度、准确性作评价。以序列直接测定法作为诊断YMDD变异的金标准,对该方法YMDD变异检测的灵敏度、特异性和诊断符合率作评价。结果该方法HBV DNA定量在103~108copy/ml范围内呈线性,精密度好(<10%),准确度高(平均回收率为97.5%)。CT(FAM)≤35,Ct设定临界值为7时,当HBV YMDD变异>25%时能检测到变异存在;Ct设定临界值为UNDETECT时,当HBV YMDD变异>50%时能检测到变异存在。以直接测序方法为金标准,该方法YMDD变异检测的灵敏度97%,特异性100%,诊断符合率99.5%。结论该方法检测HBV DNA载量和YMDD变异可以在同一管中完成,特异性高,灵敏度相对较低,但具有快速、准确、经济实用等特点。     

拉米夫定治疗过程中YMDD变异与HBVDNA载量关系的研究

目的研究拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染中YMDD变异发生与治疗前HBVDNA水平的关系。方法98例拉米夫定治疗的乙型肝炎病毒感染者,测定治疗前HBVDNA水平,定期随访,分别以PCR和PCR-RFLP法检测HBVDNA水平和YMDD变异。结果25例病例出现YMDD变异,出现的平均时间为11.2±7.45周。按治疗前病毒DNA水平分为5×102～5×104,5×105～5×106,5×106～5×108和大于5×108copies/ml四个组,YMDD发生率分别为8.3%,15.6%,30.2%和55.6%。结论乙肝患者进行拉米夫定治疗时,病毒DNA水平越高,发生YMDD的机率越大。     

阿德福韦酯治疗YMDD变异慢性乙型肝炎82例

目的:研究阿德福韦酯治疗YMDD突变后慢性乙型肝炎患者的疗效和安全性。方法:82例YMDD突变的慢性乙型肝炎患者分为对照组和试验组,对照组服用拉米夫定100mg·d-1,48周,试验组服用阿德福韦酯10mg·d-1,48周。服药后第24,48周检测谷丙转氨酶(ALT)、HBV DNA定量、HBeAg及观察不良反应。结果:试验组24及48周HBV DNA下降水平均明显高于对照组(均P<0·01),HBV DNA应答率和ALT复常率也均高于对照组(均P<0·01),HBeAg阴转率两组无显著性统计学差异。两组均未发现明显不良反应。结论:阿德福韦酯治疗YMDD突变的慢性乙型肝炎安全有效。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效和基因变异的研究

目的就拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)1a的疗效、HBV DNA P基因变异特点及编码的蛋白质的二级结构加以研究.方法 提取HBV DNA后,经半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub、DNAsis 软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果 按照ALT水平分组,各组间促进ALT正常化没有明显差异.在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,还发现了2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论 1a的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

慢性乙型肝炎患者HBV DNA YMDD变异的检测及意义

目的应用PCRmnh-ELISA法对HBV DNA YMDD变异进行检测,并对其临床意义进行初步研究。方法对我院2006年249例服用拉米夫定的慢性乙肝患者,男187例,女62例,其中HBeAg阳性198例,阴性59例,采用PCRmnh-ELISA法进行YMDD变异株检测,并进行了肝功能及HBV DNA的随访。结果249例患者中,43例YMDD变异阳性,阳性率为17.3%,其中YVDD变异33例,YIDD变异10例。YMDD变株阳性结果中,29例ALT水平呈现反复现象,占阳性结果中的67.4%,34例患者HBV DNA反跳,占阳性结果中的79.1%。结论HBV DNA YMDD变异是拉米夫定产生耐药,使病情反复的主要原因,变异的主要形式可能是YVDD,变异的发生率与E抗原阳性率无关,与治疗前的HBV DNA水平有关。     

Efficacy of lamivudine in HBeAg-negative chronic hepatitis B

Hepatitis B e antigen (HBeAg)-negative chronic hepatitis B results from infection with hepatitis B virus mutants unable to produce HBeAg. It accounts for 7-30% of patients with chronic hepatitis B virus (HBV) worldwide, with the highest rates reported for Mediterranean Europe and Asia. Interferon (IFN) is currently the only approved therapy for these patients, but it has an unfavorable tolerance profile and limited efficacy. Studies show that responses to IFN are lower in HBeAg-negative than in HBeAg-positive patients; joint HBV DNA loss/ALT normalization is obtained in 38-59% of HBeAg-negative patients treated for 4-24 months with a high rate of virological relapse (54-87%), at 6-24 months posttreatment. Lamivudine is a nucleoside analogue with potent antiviral properties against HBV. Studies show that response rates in HBeAg-negative and HBeAg-positive patients are equivalent. After 12 months of treatment, 65-96% of HBeAg-negative patients have joint HBV DNA loss/ALT normalization, although 48-74% of patients relapse within 1 year posttreatment. 60% of patients have histological improvement after 12 months of treatment. Lamivudine is well tolerated with a safety profile equivalent to that of placebo. The incidence of YMDD variants increases with extended lamivudine treatment, present in up to 57-64% of patients after 2 years. Their clinical impact is unclear; some studies show breakthrough infection associated with their emergence, whereas other studies show maintained response to lamivudine. Lamivudine has benefits over IFN in its safety and efficacy profile in this patient group. Extended lamivudine treatment beyond 2 years is an option, but further investigation is required to define stopping criteria and the impact of YMDD variants.     

实时荧光PCR、Pyrosequencing和测序法检测YMDD变异

[目的]比较测序法、Pyrosequencing和实时PCR检测拉米夫定耐药突变。[方法]对69例接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者血清标本分别进行测序、Pyrosequencing检测和实时PCR检测，分析和对比检测结果。[结果]69例血清标本中60例3种方法检测的结果完全符合，3例测序结果为YMDD的标本，Pyrosequencing检测到1例YVDD，而实时PCR检测结果为YVDD。26例测序为YIDD的标本中，Pyrosequencing和实时PCR分别检测出2例和5例混合突变。18例测序和Pyrosequencing检测为YVDD的标本中，1例实时PCR结果为YMDD。[结论]与测序法和Pyrosequencing相比，实时PCR能够在病毒群体中检测出比例更低的突变病毒。     

用套式基因扩增技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异

目的　了解套式基因扩增 (nestedPCR)技术在检测HBVP基因区酪氨酸 -蛋氨酸 -天冬氨酸 -天冬氨酸 (YMDD)变异中的敏感性和特异性。方法　用套式基因扩增技术对 3组共 85例慢性乙型肝炎患者血清进行YMDD变异检测 ,检测结果经琼脂糖凝胶电泳判断。第 1组 :4 0例未经拉米夫定治疗 ,HBVDNA >5× 10 5拷贝 /ml;第 2组 :2 4例经拉米夫定治疗 6～ 18个月 ,HBVDNA≤ 5× 10 5拷贝 /ml;第 3组 :2 1例经拉米夫定治疗 6～ 18个月 ,HBVDNA >5× 10 5拷贝 /ml。结果　第 1组检出YVDD 2例、YVDD YIDD 1例 ,检出率为 7.5 % ;第 2组检出YVDD、YIDD各 1例 ,检出率为 8.3% ;第 3组检出YVDD 4例、YIDD 2例、YVDD YIDD 3例 ,检出率为 4 2 .9%。结论　套式基因扩增技术检测YMDD变异具有较高的敏感性和特异性 ,适合变异株快速检测 ,尤其适合检测处于弱势的YMDD变异株     

苦参素联合拉米呋定对YMDD变异的临床研究

目的 :探讨苦参素联合拉米呋定 (贺普丁 )治疗慢性肝炎YMDD变异的影响。方法 :6 0例患者被随机分为治疗组 30例 ,给予贺浦丁 10 0mg·d-1,po ,同时加用苦参素 6 0 0mg·d-1,iv ,疗程 2个月 ,后 6 0 0mg·d-1,po ,疗程 4个月 ;对照组 30例单用拉米呋定 10 0mg·d-1,po。结果 :疗程结束时 (2年 ) ,观察HBV -YMDD变异率、HBeAg转换率的变化。两组患者HBeAg血清转换率分别为 4 0 .0 %和 16 .7% ,HBV -YMDD变异率分别为 2 0 .0 %和 33.3% ,治疗组疗效明显优于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :苦参素联合拉米呋定能够显著提高HBeAg血清转换率 ,降低HBV -YMDD变异发生率 ,建议两者联合应用以作为慢性肝炎的一种治疗方案     

慢性乙型肝炎YMDD变异基因的检测及分析

目的探讨慢性乙型肝炎YMDD基因变异规律。方法对未经拉米夫啶治疗和已经治疗的346例慢性乙型肝炎患者采用实时荧光定量PCR检测HBV YMDD变异基因。结果慢性乙型肝炎患者HBV YMDD变异自然存在,随着拉米夫啶用药时间的延长而显著增加。结论拉米夫啶在HBV YMDD变异中起主导作用,动态检测HBV YMDD变异对指导临床用药具有重要意义。