灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症介质分泌的影响

[目的]研究灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症的影响,初步探讨其抗炎作用机制。[方法]用噻唑蓝(MTT)法检测灯盏乙素对RAW264.7细胞活力的影响;用Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)生成的影响;用荧光素酶报告质粒法检测灯盏乙素对LPS诱导的核转录因子(NF-κB)转录活性的影响;用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB靶基因肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)m RNA表达的影响。[结果]0.01~10μmol/L的灯盏乙素处理24 h后对RAW264.7活力无显著影响;1、10μmol/L的灯盏乙素可以显著抑制LPS诱导的NO的生成及NF-κB转录活性;灯盏乙素可以不同程度的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB靶基因TNF-α、IL-1β、IL-6m RNA的上调作用。[结论]灯盏乙素可能通过抑制NF-κB的活化及炎症因子的表达发挥一定的抗炎作用。     

半边旗有效成分5F体内外的抗炎作用

目的:通过建立体内外炎症模型,观察半边旗有效成分5F的抗炎作用。方法:建立脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型,并用不同浓度5F处理,CCK-8法检测5F的细胞毒性,采用Griess法检测上清液中一氧化氮(NO)含量,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)含量,Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和环氧酶-2(COX-2)表达水平。雄性ICR小鼠60只,建立巴豆油和花生四烯酸诱导的耳肿胀模型,造模后随机分为模型组、阳性组和5F组,每组10只,5F组给予100 mg·kg-15F溶液,阳性组给予地塞米松0.8 mg·kg-1或吲哚美辛1 mg·kg-1,模型组给予同体积生理盐水。各组均连续给药7 d。观察5F对小鼠耳肿胀的抑制作用。结果:5F在0~40 mg·L-1的剂量内对RAW264.7细胞无明显毒性作用,10,20,40 mg·L-1的5F可依赖性抑制LPS诱导的NO释放(P<0.01),20,40 mg·L-1的5F可以降低PGE2含量(P<0.01),40 mg·L-1的5F显著性抑制i NOS和COX-2蛋白表达(P<0.05),10,20,40 mg·L-1的5F显著降低TNF-α和IL-1β含量(P<0.01),20,40 mg·L-1的5F显著降低IL-6含量(P<0.01),100 mg·kg-1的5F对巴豆油和花生四烯酸诱导的耳肿胀都有显著抑制作用(P<0.05)。结论:5F可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,抑制巴豆油和花生四烯酸诱导的耳肿胀,其抗炎作用与抑制i NOS和COX-2表达,减少炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6,NO和PGE2含量有关。     

地乌三萜皂苷W1对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响

目的探讨地乌三萜皂苷类成分W1对体外破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。方法3个不同浓度（0．0625,0．125,0．25μg／ml）的W1与核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kB ligand,RANKL）诱导的小鼠单核／巨噬细胞RAW264．7共孵育7天,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色观察TRAP阳性多核细胞的形成,甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察骨吸收陷窝的形成,图像分析计算骨吸收陷窝面积百分比;同3个浓度的W1与RANKL诱导的RAW264．7细胞共孵育24小时后收集细胞上清液,放射免疫法检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的含量;甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测W1对RAW264．7细胞毒性影响。结果RANKL组诱导RAW264．7细胞形成多量TRAP阳性多核细胞,形成明显的骨吸收陷窝,并诱导TNF-α在RAW264．7细胞上清中异常高表达;与RANKL组相比,3个浓度的W1均能显著减少TRAP阳性细胞数（P〈0．01）,显著减少骨吸收陷窝面积（P〈0．01,P〈0．001,P〈0．001）,明显降低TNF-α的表达量（P〈0．05,P〈0．01,P〈0．01）,且未观察到对RAW264．7的细胞毒性。结论W1对由RANKL诱导的体外破骨细胞分化和骨吸收功能有一定的负调节作用。     

二苯乙烯苷抗氧化和抗炎作用的机制研究

目的： 以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象，探讨二苯乙烯苷（TSG）介导的抗氧化和抗炎作用及其调控机制。方法： 30、60和120 μmol/L的二苯乙烯苷预处理4 h，然后以1 μg/mL的脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞（RAW264.7）12 h，并设置空白对照组、地塞米松（100 nmol/L）阳性对照和Nrf2抑制剂寒鸦子酸（brusato，50 μmol/L）干预组，其中地塞米松和brusatol预处理RAW264.7细胞4 h。观察光镜下RAW264.7细胞形态学的改变并统计其被激活比例；ELISA法检测培养液中TNF-α和IL-6的水平；通过DCFH-DA和Mito-SOX^TM荧光探针染色，流式细胞仪检测细胞内和线粒体内的ROS水平变化；免疫荧光法检测Nrf2的表达水平变化；Western blot检测核内Nrf2蛋白水平变化；Real-time PCR测定Nrf2下游抗氧化酶HO-1、SOD₂、SOD₁、CAT和GPX-1表达。结果： 与空白对照组细胞相比，LPS处理后RAW264.7细胞活化，胞体增大，形成大量伪足，培养基中TNF-α和IL-6增多。二苯乙烯苷可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞激活，降低培养基中TNF-α和IL-6，且效果优于阳性对照药物地塞米松。同时，二苯乙烯苷可促进Nrf2核转位，并促进下游抗氧化酶HO-1、SOD₂和CAT表达，减轻细胞内ROS生成。而brusatol可通过阻断Nrf2活性抑制二苯乙烯苷的抗炎作用。结论： 二苯乙烯苷可激活Nrf2及其下游抗氧化酶的表达，具有良好的抗炎和抗氧化作用，是一种炎症相关疾病的候选药物。     

脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成

目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。     

TNF-α及TNF-α抗体对破骨细胞V-ATP酶的影响

目的研究不同浓度的TNF-α及TNF-α抗体对破骨细胞上V-ATP酶表达量的影响。方法体外诱导小鼠RAW264.7细胞分化为破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞生成情况。然后将破骨细胞分为对照组、TNF-α干预组及TNF-α抗体干预组,TNF-α干预组、TNF-α抗体干预组分别用低、中、高三种浓度的TNF-α、TNF-α抗体干预48 h。用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)、Western blot检测破骨细胞V-ATP酶的mRNA和蛋白表达水平。结果 TRAP染色检测提示有多核破骨细胞生成。TNF-α处理组V-ATP酶mRNA表达水平显著高于对照组(P0.001);TNF-α抗体处理组V-ATP酶mRNA表达水平显著低于对照组(P0.001)。同时,TNF-α处理组V-ATP酶蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05);TNF-α抗体处理组V-ATP酶蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05)。结论 TNF-α可提高破骨细胞V-ATP酶的表达;TNF-α抗体可抑制破骨细胞V-ATP酶的表达。上述提示TNF-α可能通过提高破骨细胞V-ATP酶的表达从而增加破骨细胞的骨吸收作用。     

M—CSF诱导MnSOD表达减轻RAW264.7细胞氧化损伤

为探讨巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）对单核巨噬细胞氧化损伤的保护作用,以富含M－CSF的小鼠L929细胞条件培养液（L929－CM）作为M－CSF来源,以小鼠巨噬细胞系RAW264．7为模型,从形态学上观察了M－CSF对叔丁基氢过氧化物（tbOOH)引起的RAW264。7细胞氧化损伤的保护作用;并采用酶活性测定、TR－PCR等方法,他M－CSF对RAW264．7细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性及基因表达的影响。结果发现,M－CSF可以减轻tbOOH对RAW264．7细胞的氧化损伤;M－CSF可以提高细胞总SOD活性;M－CSF还可增强RAW264．7细胞MnSOD mRNA的表达,且这一诱导作用可被放线菌素D（actinomycinD)阻断。提示M－CSF可通过诱导细胞MnSOD表达而减轻RAW264．7细胞的氧化损伤。     

Anti‐inflammatory effects of chemical components from Ginkgo biloba L. male flowers on lipopolysaccharide‐stimulated RAW264.7 macrophages

Ginkgo biloba L., well known as living fossil, have various pharmacological activities. Eighteen compounds were isolated from Ginkgo male flowers including a novel matsutake alcohol glycoside, Ginkgoside A ( 1 ), and 17 known compounds—calaliukiuenoside ( 2 ), benzylalcohol O‐α‐l ‐arabinopyranosyl‐(1 → 6)‐β‐d ‐glucopyranoside ( 3 ), amentoflavone ( 4 ), sciadopitysin ( 5 ), bilobetin ( 6 ), isoginkgetin ( 7 ), olivil 4‐O‐β‐d ‐glucopyranoside ( 8 ), dihydrodehydrodiconiferyl alcohol‐4‐O‐β‐d ‐glucoside ( 9 ), (+)‐cyclo‐olivil‐6‐O‐β‐d ‐glucopyranoside ( 10 ), (?)‐isolariciresinol 4‐O‐β‐d ‐glucopyranoside ( 11 ), coniferin ( 12 ), trans‐cinnamic acid‐4‐O‐β‐d ‐glucopyranoside ( 13 ), p‐coumaryl alchol glucoside ( 14 ), stroside B ( 15 ), methylconiferin ( 16 ), cis‐p‐coumaric acid 4‐O‐β‐d ‐glucopyranoside ( 17 ), and cis‐coniferin ( 18 ). Thirteen of these compounds had not previously found in Ginkgo. All extractive fractions and isolated compounds were evaluated for their anti‐inflammatory ability in the lipopolysaccharide‐induced RAW264.7 macrophages. The ethanol extract of Ginkgo flowers and the chloroform and ethyl acetate fractions can significantly decrease nitric oxide (NO), interleukin‐6 (IL‐6), and prostaglandin E₂ (PGE₂) production at 100 μg/ml. The most effective compounds, bilobetin ( 6 ) and isoginkgetin ( 7 ), elevated the NO inhibition ratios to 80.19% and 82.37% at 50 μM, respectively. They also exhibited significant dose‐dependent inhibitory effects on tumor necrosis factor‐α, IL‐6, PGE₂, inducible NO synthase mRNA, and cyclooxygenase‐2 mRNA levels. So they can be promising candidates for the development of new anti‐inflammatory agents.