重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶的纯化及其动力学性质

目的纯化重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶（ＨＩＶ－１ＲＴ），筛选新的ＨＩＶ－１ＲＴ抑制剂。方法在适宜的培养条件下诱导工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ＰＫＲＴ２）可高效表达重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）逆转录酶（ＲＴ）。应用ＤＥＡＥ－纤维素和磷酸纤维素离子交换柱层析法从细菌裂解液中分离、纯化重组ＲＴ。结果１升细菌培养液可得到１．１ｍｇ产物。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示所纯化的重组ＲＴ为由两个分子量分别为６６ｋＤ和５１ｋＤ的亚基组成的杂二聚体。酶活性测定结果表明，经纯化的重组ＲＴ具有很高的逆转录酶活性（比活力为１．４×１０４ｕｍｇ）。结论本文通过对ＲＴ反应条件的研究，优化了ＲＴ反应系统，并测定了磷甲酸钠（ＰＦＡ）对重组ＲＴ的抑制效应，结果表明ＰＦＡ对重组ＲＴ的抑制反应动力学机制与天然ＲＴ相同，从而进一步说明用此法纯化的重组ＲＴ可直接用于抗ＨＩＶ药物的筛选与评价。     

链球菌M6蛋白的纯化及其在银屑病患者血清检测中的应用

为了进一步研究A群化脓性链球菌M6蛋白和点滴型银屑病之间的关系 ,我们对银屑病患者咽部菌群进行分离培养〔1〕 并对培养分离的链球菌中的M6蛋白基因进行检测〔2〕,对检测具有M6蛋白的化脓链球菌菌株再进行增殖培养 ,然后采用分子筛和阴离子交换层析的方法对链球菌菌体中的M6蛋白进行纯化 ,现将结果报道如下 :材料和方法A群化脓性链球菌 :从点滴型银屑病患者咽部培养获得的化脓性链球菌 ,接种至 10 %羊血斜面上 ,37℃培养过夜后 ,接种于液体培养基 ,经 10 0 0 0r min离心 30min ,收集菌体。用 0 .0 2mol L ,pH7.4的PBS缓冲液将化脓性链…     

兔抗MAGE-n血清的制备、纯化及鉴定

目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清。方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose4B(CNBr-ActivatedSephrose4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、ELISA、Westernblot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定。结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白。结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础。     

真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

目的 真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,SV)融合蛋白(fusion protein,),并完成蛋白纯化及纯度测定.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,CR方法扩增出3'端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,2 h后再用Westem blot检测目的蛋白的表达.Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度.结果 核酸序列分析证实获得带His标签的RSV F基因序列,没有发生无义突变.转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上.结论 初步建立了真核表达RSV F蛋白的纯化方法,为进一步优化RSV F蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础.     

两种兔源内毒素结合蛋白的分离、纯化及其体外生物学活性的对比研究

目的　从烧伤合并内毒素血症致多器官损害家兔血清中分离纯化内毒素结合蛋白 ,并初步对比研究它们的生物学活性。方法　兔血清蛋白质通过二步离子交换层析 (Bio Rex 70Resin、Mono Q)及凝胶过滤分离纯化 ,并经流式细胞分析实验、绵羊红细胞凝聚实验、氨基末端氨基酸残基测序等方法鉴定 ,再将所获蛋白质作用于体外培养的人单核细胞 (U937) ,观测其分泌TNFα等细胞因子的生物效应。结果　获得两种具有促进内毒素 (LPS)与外周血单核细胞 (PBMC)结合的蛋白质 ,其中一种相对分子质量为 6 0× 10 4 ,其N端 10个氨基酸序列为TNPGLITRIT ,证实为兔内毒素结合蛋白 (LBP) ;另一种蛋白质相对分子质量为 4 8× 10 4 ,其N端 10个氨基酸序列为GSQGTFTSEE ,与NCBI蛋白质库中的氨基酸序列进行比较 ,未发现相同序列 ,命名为p48。结论　p48与LBP具有相似的生物学功能 ,p48的生物学活性稍弱于LBP。提示体内除LBP外 ,p48也同样起着介导LPS的毒性作用。这可能是近年国外研究中阻断LBP的活性后 ,机体毒性反应并无明显减轻的原因之一。     

铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。     

ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备

目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了ERCC1蛋白.SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37 000.获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株(6F8), 其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶ 1.5×106.Western blot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性.结论:成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb.     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

乳腺癌易感基因BRCAl的BRCT结构域的融合表达及纯化

乳腺癌易感基因BRCAl在乳腺癌发生、发展中起着重要作用。在其C-末段有两个串联重复的BRCT(BRCTl和BRCT2)结构域。它们与BRCAl的重要功能密切相关，BRCT结构域还存在于其它50多种蛋白中。本文用PCR方法扩增了BRCTl和BRCT2结构域编码序列，并将其以正确相位与pGEX—2T载体中的GST编码序列融合，构建成重组质粒pGST—BRCTl和PGST—BRCT2。将这两种重组质粒分别转化E．coli DH5α后，分别表达了GST—BRCTl和GST—BRCT2两种融合蛋白。Western blot检测结果表明，两种融合蛋白均能与GST抗体反应。表达的GST—BRCTl和GST—BRCT1经GST—Sepharose 4B亲和层析获得了纯化的融合蛋白，为BRCT结构域及其相关蛋白功能研究提供了有用的材料。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的制备级复性和纯化

目的通过优化复性液的组成、pH值、稀释度等,建立幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,cagA)表达产物的制备级复性及纯化方法。方法以包涵体形式存在的cagA表达产物先用5mL/LTritonX-100进行初步纯化,使其纯度达到约90%;再用含8mol/L脲的变性剂溶解包涵体,用复性液[0.1mol/LTris-HCl、2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、8mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)及50mmol/L精氨酸(Arg),pH8.0]稀释复性后,用DEAE-HP阴离子交换色谱进行纯化。结果用稀释法复性及液相色谱法纯化,一次可得到100~140mg的cagA。ELISA检测其抗原活性为1∶16000;SDS-PAGE检测纯度为98%。结论用制备级复性、纯化制备的cagA,可作为抗原用于制备检测抗幽门螺杆菌抗体的检测芯片,效果良好,并已获得国家新药批文。