重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶的纯化及其动力学 …

目的 纯化重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶，筛选新的ＨＩＶ－１ＲＴ抑制剂。方法在适宜的培养条件下诱导工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ＰＫＲＴ２）可高效表达重组人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）逆转录酶（ＲＴ）。应用ＤＥＡＥ＿纤维素和磷酸纤维素离子交换柱层析法从细菌裂解液中分离、纯化重组ＲＴ。结果 １升细菌培养液可得到１．１ｍｇ产物，ＳＤＳ－聚炳 烯酰胺凝胶电泳分析显示所纯化的重组ＲＴ为由两个分子量分别为     

抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达

目的研究人源抗人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｇｐ１２０单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法以人工合成的ＨＩＶ－ｌｇｐ１２０Ｖ３环多肽为抗原，利用噬菌体抗体库技术，筛选含有抗－ｇｐ１２０ＳｃＦｖ基因的噬菌体，提取质粒，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，表达可溶性ＳｃＦｖ。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物分子量为２８ｋＤ左右，且具有ｃ－ｍｙｃ活性；ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，可溶性ＳｃＦｖ具有较好的抗原结合活性和较强的特异性；竞争性ＥＬＩＳＡ实验结果进一步证明表达产物的特异抗－ｇｐ１２０活性。结论该技术便捷有效，可大量获得人源抗ＨＩＶ抗体片段，为进一步研究抗ＨＩＶ抗体的生物活性和ＨＩＶ感染诊治打下基础     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆？…

目的 提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核中的表达量。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ＰＥＴ２８ａ得到重组质粒ｐＥＴ／１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果 间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒ     

在免疫细胞亚群中用超敏荧光原位杂交监测HIV-1治疗

ＨＩＶ－１病毒动力学研究已经显示在细胞内ＨＩＶ－１每天复制产生１百万以上颗粒，高效抗逆转录病毒治疗（ＨＡＡＲＴ）在数周内减少血浆ＨＩＶ－１ＲＮＡ数量，而且，存在于淋巴结和扁桃腺细胞内病毒宿主起到第二次序病毒衰弱，当治疗失败或病人不依从后，细胞宿主的ＨＩＶ－１仍然保持可以恢复病毒载量到治疗前水平。 血样本来自５例病人治疗前，用齐多夫定２００ｍｇ（ｔｉｄ）、拉夫咪啶１５０ｍｇ（Ｂｉｄ）和Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ ８００ｍｇ（ｔｉｄ）治疗后４周、１２周和２４周。校正扩增逆转录酶（Ａｍｐｌｉｃｏｒｒｅｖｅｒｓｅ…     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆菌中的高效表达

目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ｐＥＴ２８ａ，得到重组质粒ｐＥＴ１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果表明，ｇｐ１２０表达量占总菌体蛋白的５０％。结论在原核系统中高效表达了ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因     

人类免疫缺陷病毒I型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达

目的 基因重组表达（ＨＩＶ－１ ｇｐ４１）抗原,并研制一种快速,简便,灵敏性高,特异性强的国产ＨＩＶ－１免疫检测试剂。方法 选用ＨＩＶ－１型ＢＨ１０毒株的包膜糖蛋白ｇｐ４１的部分基因（６９７７－７４９７）,重组在ＰＢＶ２２１表达载体上。表达产物通过１５％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离纯化,根据ＲＦ值,切下含特异蛋白的胶带,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法转移在硝酸纤维素膜上;     

人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建

目的为研究我国云南１型人类免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ－１）流行株外膜蛋白（ｇｐ１２０）的有关抗原表位。方法采用套式聚合酶链式反应，以来自云南流行区ＨＩＶ－１感染者的外周血单核巨噬细胞基因组为模板，进行云南流行株外膜蛋白基因（ｅｎｖ）片段的扩增，并将ｅｎｖ基因片段与原核表达载体ｐＢＶ２２０进行重组，构建成质粒ｐＹＮｅｎｖ并在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ｂ）中获得表达。采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定。结果含重组质粒的宿主菌经３０℃２０小时培养后，转入４２℃培养５小时，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析有重组蛋白的表达。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应证实，该重组蛋白可与来自该流行区的ＨＩＶ－１感染者血清（含多克隆抗体）发生特异反应。结论该重组膜蛋白可作为抗原用于ＨＩＶ－１膜蛋白抗体的检测，并为进一步研究ＨＩＶ－１ｇｐ１２０的病理机制奠定了基础。     

HIV-1蛋白酶和逆转录酶抗药基因变异检测方法的建立及临床应用

目的 应用现有ＤＮＡ序列分析技术对人类免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）的蛋白酶（ＰＲ）和逆转录酶（ＲＴ）基因进行简便、快速、准确的序列分析,在临床上为ＨＩＶ－１患者治疗方案的确定提供可靠依据。方法 从ＨＩＶ－１感染者血清中提取ＲＮＡ,用套管式逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增ＨＩＶ－１的ＰＲ和ＲＴ基因片段,并对此片段进行核苷酸序列分析。结果 本方法对血清中ＨＩＶ－１ＲＮＡ含量约２０００拷贝／ｍｌ以上的样品都能有效扩增。在序列分析时背景干扰少,对２５％左右的混合序列均能准确反映。通过对临床治疗病人进行动态序列分析观察,发现在药物治疗过程中,病人血浆中ＨＩＶ－１ＲＮＡ含量变化与ＰＲ和ＲＴ基因抗药性变异具有很大相关性。结论 ＰＲ和ＲＴ基因序列分析方法能够及时、准确地反映ＨＩＶ－１患者在抗病毒药物治疗过程中病毒的变     

HIV感染中的ADE作用

近年来在人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染中发现的抗体依赖的病毒感染增强作用（ＡＤＥ）已引起越来越广泛的关注。ＡＤＥ作用的两种形式，即Ｆｅ受体介导的ＡＤＥ（ＦｃＲ－ＡＤＥ）和补体受体介导的ＡＤＥ（ＣＲ－ＡＤＥ），分别与ＨＩＶ病毒包膜糖蛋白的特定结构哉ｇｐ４１和ｇｐ１２０有关，ＡＤＥ作用在艾滋病（ＡＩＤＳ）病情进展及疫苗研制和应用等方面的在重要的生物学意义。本文综述了ＡＤＥ作用的类型、可能的机制及病理学     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的：克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。 方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因，双酶切构建重组质粒，转化E.coliJM109，诱导表达HlyX；将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，Western blotting鉴定其免疫原性；将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞，通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。 结果:扩增出1 179 bp的目的基因HlyX，重组质粒经双酶切、PCR鉴定，测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64 kD，主要以包涵体的形式表达，经免疫动物得到多克隆抗体，ELISA检测效价达1∶〖KG-*2〗64 000； Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组（P<0.01）。 结论:HlyX能在大肠杆菌中表达，表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。     

Recombinant Escherichia coli clones expressing Chlamydia trachomatis gene products attach to human endometrial epithelial cells.

To identify Chlamydia trachomatis genes involved in attachment to host cells, a chlamydial genomic library was screened on the basis of binding characteristics by two methods. In the whole-cell screen, individual recombinant Escherichia coli clones were assayed for adherence to eukaryotic cells. In the membrane-binding screen, each recombinant colony of E. coli was treated with CHCl3 and assayed for binding to purified, 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)-solubilized, 35S-labeled eukaryotic membrane material. Initial screening with McCoy cells was refined by using HEC-1B cells, a human endometrial epithelial cell line, which discriminate among recombinants adhering to McCoy cells. Some recombinants demonstrate significantly greater adherence to HEC-1B cells than to McCoy cells and appear, by transmission electron microscopy, to associate with electron-dense areas of the epithelial cell plasma membrane, resembling coated pits. Recombinants positive by one or both screening methods were examined by Southern and Western (immunoblot) analyses, which revealed the presence of chlamydial sequences inserted in the plasmids and the expression of novel 18-, 28-, and approximately 82 kDa, and perhaps of 18 Maxicell analysis of selected recombinants confirmed that the proteins of 28 and approximately 82 kDa, and perhaps of 18 kDa, are plasmid encoded. Antiserum generated against the recombinant approximately 82-kDa protein reacted in Western analysis with a similar-sized protein from C. trachomatis serovar E elementary bodies (EB) and reticulate bodies, serovar L2 EB, and C. psittaci EB. E. coli JM109(pPBW58) contains a 6.7-kb plasmid insert which encodes proteins of all three sizes. Under a number of different conditions in the whole-cell attachment assay--i.e., at 4 degrees C, in Ca(2+)- and Mg(2+)-free medium, in the presence of trypsin or dextran sulfate, and with rabbit aortic endothelial cells--the binding specificity of JM109(pPBW58) parallels that of C. trachomatis EB. Finally, the adherence phenotype of E. coli JM109(pPBW58) correlates directly with the presence of the recombinant plasmid; the phenotype is lost concurrently with loss of the recombinant plasmid, and the into E. coli JM109. The role of the 18-, 28-, and approximately 82-kDa proteins in mediating attachment, whether they act in concert as a complex or individually, has yet to be determined.     

人受精相关抗原-1的基因克隆及原核表达

目的为了阐明免疫性不孕不育的原因,检测血清中存在的抗精子抗体的种类,构建重组人受精相关抗原-1（recombinant human Fertilization antigen-1,rhFA-1）的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。方法采用RT-PCR法,从人睾丸组织总RNA中扩增获得人FA-1的cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建人源性FA-1的重组原核表达质粒pBV220/FA-1。重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌JM109并在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白。结果测序表明重组基因序列与人FA-1基因完全一致。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的相对分子量为14.6KDa与预期结果相符。结论获得了人FA-1的编码基因,并在大肠杆菌中表达了人的FA-1蛋白。     

Expression of an epitopic region of AspfI, an allergen/antigen/cytotoxin of Aspergillus fumigatus

The gene for an 18 kD allergen/cytotoxin of Aspergillus fumigatus was cloned in pUC-19 vector and expressed in Escherichia coli JM109. Digestion of this gene with AluI resulted in four fragments of 216bp, 120bp, 39bp and 21bp. These fragments were cloned in the Sma-I site of pUC-19. The recombinants thus, generated after transformation in E. coli JM109, were screened using monoclonal antibodies raised against the AspfI. The fusion protein containing 120 bp AluI fragment was recognised by the MoAb indicating presence of epitope(s) in the 120 bp region. The study indicates a viable strategy for identification and expression of an immunologically active domain of a major allergen/antigen of A. fumigatus for the first time.     

HIV—1gp41基因的分段克隆和表达

目的 在大肠杆菌中表达HIV－1gp41N肽和C肽基因。方法 用PCR方法从含HIV－1gp160基因的质粒中扩增HIV－1gp41N肽和C肽基因,重组人pGEX-4T-1载体,并亚克隆人pGEM7zf( )中测定核苷酸序列,限制性酶切鉴定后进行原核表达。结果 成功地扩增到HIV－1gp41N肽和C肽基因,酶切鉴定及测序结果与已知HIV－1亚型的gp41N肽区和C肽区基因序列一致,SDS－PAGE结果显示,表达出与预期分子量大小相同的蛋白。结论 N肽和C肽基因的成功表达,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌全长hpaA基因克隆和在大肠杆菌中高效表达

为了构建幽门螺杆菌（H.pylori)全长hpaA基因表达质粒,在大肠杆菌中表达重组HpaA(reHpaA)蛋白,我们用PCR扩增全长hpaA基因,经适当的酶切－连接反应将其连入原核表达质粒pTrc99A,反应产物转化大肠杆菌JM105,用Amp( )培养基筛选,提取重组菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆,并用重组菌质粒进行hpaA基因测序。阳性克隆经IPTG诱导培养,用SDS－PAGE电泳和Western blot进行reHpaA表达分析和鉴定,用薄层扫描分析reHpaA含量。结果显示,重组质粒pTrc99A-hpaA经PCR和酶切后均产生783bp hpaA基因。重组菌能表达约30kD reHpaA蛋白,含量占全菌体蛋白量的51．99％,Western blot证实其有免疫反应性。重组H.pylori HpaA表达质粒的成功构建及在大肠杆菌中高效表达的实现,为探索制备H.pylori疫苗奠定了一定基础。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2蛋白高效表达和纯化

目的在前期的研究中，DAZAP2基因在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）患者中表达明显下调，可能为MM的负性基因．须进一步获得DAZAP2蛋白，制备抗体，从而在蛋白水平上研究DAZAP2的表达、结构和功能．方法将原核重组质粒pQE30－DAZAP2转化大肠杆菌，阳性菌株经1 mmol／LIPTG诱导表达目的蛋白，再经过纯化和透析结果IPTG诱导4hr时，得到大量重组目的蛋白，占可溶蛋白的20％左右，经过Ni—NTA层析柱纯化。获得分子量为17kD的DAZAP2蛋白浓度为0．97mg／m1．结论DAZAP2蛋白获得高效表达，并且建立快速简便的纯化方法，目的蛋白可以用于下一步的实验．     

Immunologic characterization of a 35-kilodalton recombinant antigen of Mycobacterium tuberculosis.

A 35-kilodalton (kDa) recombinant antigen (35-kDa antigen) produced by Escherichia coli JM107 carrying DNA from Mycobacterium tuberculosis was purified and immunologically examined by in vivo and in vitro methods. A monoclonal antibody (2B2) was produced against the 35-kDa antigen. The protein was purified from the insoluble fraction of the recombinant E. coli strain by either affinity chromatography with the 2B2 monoclonal antibody or preparative isoelectric focusing. In enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot (immunoblot) analyses, antibody to 2B2 reacted with whole-cell sonic extracts of M. tuberculosis and other slowly growing mycobacteria but not with two rapid growers, M. chelonae and M. fortuitum. An injection series totaling less than 1 mg of purified protein without adjuvant elicited a humoral response in guinea pigs. In one guinea pig, 10 micrograms of purified protein injected intradermally elicited both a humoral and a cell-mediated response. Results of these studies suggest that the 35-kDa antigen is a membrane-associated protein that stimulates both humoral and cell-mediated immune responses and should be evaluated as a vaccine candidate.     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。