侧壁开窗法上颌窦底提升术植入Bio-Oss后骨生成的mRNA表达谱

 目的：探讨侧壁开窗法上颌窦底提升术这种特殊的引导性骨再生（guided bone regeneration, GBR）过程的转录组特点。方法：3只Beagle犬,随机选择一侧经侧壁开窗行上颌窦底提升术,同时植入Bio-Oss骨粉,术后2周,对另一侧用相同的方法行上颌窦底提升术。第2次术后2周,收集植入的Bio-Oss骨粉组织块,提取总RNA,全基因组表达谱芯片检测分析上颌窦底提升后2周和4周时的差异表达基因。利用基因本体论（gene ontology, GO）对差异表达的基因进行功能分类,以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）进行信号通路分析。结果：在2周时表达升高的基因与刺激反应、免疫-炎症反应和细胞增殖有关,同时,与神经元分化、破骨细胞分化和早期血管化过程相关的基因也高表达。在4周时,与细胞代谢和发育相关的基因表达升高,重要的是,与血管生成和骨骼发育相关的基因都高表达,与骨骼发育相关的基因包括骨生成相关的生长和分化因子［转化生成因子β1（transforming growth factor beta 1, TGFB1）和骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4, BMP4）］、软骨和骨胞外基质［软骨黏附素（chondroadherin, CHAD）、Ⅰ型胶原α1链（collagen type I, alpha 1 chain, COL1A1）、Ⅰ型胶原α2链（collagen type I, alpha 2 chain, COL1A2）、Ⅴ型胶原α2链（collagen type Ⅴ, alpha 2 chain, COL5A2）、核心蛋白聚糖（decorin, DCN）、骨连接蛋白（osteonectin, SPARC）和骨钙素（osteocalcin, BGLAP）］等相关的基因。信号通路分析显示4周时表达升高的基因与转化生长因子β/骨形态发生蛋白（transforming growth factor beta/bone morphogenetic protein, TGF-β/BMP)信号通路有关。无翅型MMTV整合位点家族（wingless-type MMTV integration site family, WNT）信号通路中的关键基因WNT5A和卷曲蛋白受体9（frizzled receptor 9, FZD9）在2周时表达升高,而连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）在4周时表达升高。结论：侧壁开窗法上颌窦底提升术2周后转录表达谱变化以免疫-炎症反应和破骨反应下调、骨生成相关基因表达升高为特点,骨再生的过程还与神经生成和血管生成过程相关。在骨再生的过程中,TGF-β/BMP和WNT信号通路起重要作用,WNT信号通路的作用复杂。     

小鼠脊髓灰质发育过程中细胞迁移与血管之间的关系

目的:探讨小鼠神经系统发育过程中脊髓成熟神经元迁移与血管发育之间的关系。方法:不同年龄小鼠共计75只,应用免疫荧光及墨汁灌注的技术,标记小鼠胚胎E17到P30脊髓神经元和血管。结果:大约在胚胎E17左右,小鼠脊髓灰质内开始出现NeuN阳性的神经元,白质中神经元较少,且此时灰质和白质内血管分布均匀,管径一致,分支较少。随着年龄的增长,脊髓周围的神经元不断向内迁移,灰质内NeuN阳性的神经元数先增多后减少且血管体密度先增加后减小,而白质内的神经元持续减少,血管逐渐稀疏。P14以后,脊髓灰质内的血管密度明显高于白质内的血管密度。同时,研究中还发现部分NeuN阳性细胞紧贴着血管分布。结论:在小鼠脊髓的发育过程中,NeuN阳性细胞由脊髓周围逐渐向中心迁移,和脊髓灰质H形态的形成密切相关。同时,血管扮演着重要的角色,它可能通过与神经元的相互作用,引导神经元的迁移,并且为神经元的迁移提供路径和支架。     

单环刺缢及同种异体神经制成人工神经修复神经缺损

目的:研究去细胞的单环刺缢体壁和同种异体神经所构成的人工组织神经的组织相容性及其修复神经缺损的效果。方法:取大鼠40只随机分成实验组、自体神经组、硅胶管组、正常组。实验组将去细胞的单环刺缢体壁缝合成神经导管,其内充填去细胞的异体神经,修复大鼠10 mm坐骨神经缺损。术后4月,通过大体观察,组织形态学观察,了解该人工组织神经修复大鼠坐骨神经缺损的疗效。结果:该人工组织神经组织相容性良好,神经功能恢复效果正常组>自体神经组>实验组>硅胶管组,实验组疗效与自体神经组接近,明显优于硅胶管组。结论:将去细胞的单环刺缢体壁和同种异体神经制成人工组织神经修复周围神经缺损是可行的。     

NMDA对新生大鼠皮层神经元的兴奋毒作用

目的:建立NMDA诱导原代培养皮层神经元兴奋毒损伤模型,探讨NMDA对NMDA受体过度活化诱导兴奋性神经毒的可能途径。方法:原代培养新生大鼠大脑皮层神经元,通过倒置显微镜形态学观察、细胞活力检测(MTT及LDH释放的检测)及胞内Ca2+的动态测定,探索NMDA诱导毒性作用的适当浓度及时间。通过对ROS、NO检测,分析NMDA诱导毒性作用于线粒体的损伤情况。结果:NMDA(100μmol/L/2 h)引起皮层神经元形态学改变,且引起神经元细胞活力时间和浓度依赖性的下降,由同时伴随LDH释放增加(P<0.05),ROS和NO的生成量明显增加(P<0.05),皮层神经元内Ca2+的快速升高,并维持在高水平。结论:NMDA诱发皮层神经元明显的细胞毒性作用,提示NMDA过度活化NMDA受体后通过神经元膜内Ca2+超载造成ROS和NO的生成量增加,导致皮层神经元产生毒性损伤。     

原发性高血压进程中下丘脑内神经元型一氧化氮合酶和血管紧张素Ⅱ1型受体的共表达

目的:观察Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)下丘脑室旁核(PVN)和视上核(SON)内神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT-1R)的共表达,以及加压素(AVP)和nNOS基因水平的表达差异.方法:应用免疫荧光双标染色结合RT-PCR技术.结果:SHR和WKY大鼠PVN和SON内都有大量的nNOS和AT-1R免疫阳性神经元分布并部分共存,但SHR组nNOS和AT-1R共存率明显高于对照组.与之一致,SHR组PVN和SON内nNOS和AVP mRNA含量都高于对照组.结论:在高血压发病进程中,NO发生代偿性增加,可部分负反馈抑制中枢肾素-血管紧张素系统,但这种抑制不能完全逆转过度激活的血管紧张素Ⅱ和AVP.     

补阳还五汤联合神经干细胞移植促进脊髓损伤髓鞘再生

目的:探讨补阳还五汤(BYHWD)灌胃联合神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤(SCI)后髓鞘再生的影响.方法:将48只成年雌性SD大鼠随机分为脊髓损伤(SCI)组、BYHWD灌胃组、NSCs移植组、NSCs移植联合BYHWD灌胃(BYHWD+ NSCs)组.SCI组不做治疗;NSCs组于脊髓横断后局部移植NSCs; BYHWD+ NSCs组移植NSCs,并每天BYHWD灌胃;各组在损伤后14、28 d后分别留取损伤脊髓标本,用免疫荧光双标法检测髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达情况,透射电镜观察脊髓白质内髓鞘超微结构变化.结果:BYHWD+ NSCs组MBP阳性表达最多,较其他3组差异有统计学意义.电镜下BYHWD+NSCs组髓鞘结构较为规整,轴突微丝、微管排列有序,线粒体结构完整,可见薄髓的再生髓鞘.结论:SCI后BYHWD灌胃联合NSCs移植能够促进损伤脊髓MBP的表达及脱髓的轴突再髓鞘化.     

消肿止痛合剂对大鼠随意皮瓣血管再生的影响

目的:观察消肿止痛合剂对大鼠随意皮瓣血管再生及血管内皮生长因子(VEGF)-Dll4/Notch信号通路的影响。方法:将240只健康SD大鼠随机分为6组,分别为空白组、假手术组、模型组、消肿止痛合剂组(消肿组)、消肿止痛合剂+Notch阻断剂MK-0752(MK)组(消肿+MK组)和消肿止痛合剂组+VEGF受体抑制剂axitinib(AXI)组(消肿+AXI组)。观察皮瓣毛细血管充盈时间;HE染色观察皮瓣组织新生毛细血管的数量、微血管密度、微血管管径及血管成活面积;ELISA法检测血清中VEGF的含量;RT-qPCR检测大鼠皮瓣组织中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表达水平。结果:与模型组相比,消肿组第10天毛细血管充盈时间降低(P<0.05);与消肿组相比,消肿+AXI组的毛细血管充盈时间增加(P<0.05)。模型组大鼠皮瓣组织细胞排列紊乱,细胞核稀疏,可见明显水肿和大量白细胞浸润;消肿组和消肿+MK组水肿明显减轻,组织间隙炎症细胞浸润减少,其中消肿+MK组减轻更为明显。与模型组相比,消肿组微血管数量、密度和面积均显著增加,VEGF的含量显著增加,VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表达量显著升高(P<0.05);与消肿组相比,AXI干预后微血管数量、密度和面积均显著减少,VEGF的含量降低,VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表达量降低(P<0.05);MK干预后,VEGFA的mRNA表达水平升高,而Notch和Dll4 mRNA表达增加的趋势被有效抑制(P<0.05)。结论:消肿止痛合剂能够促进皮瓣术后血管的再生,从而增强了随意型皮瓣的成活率,可能与影响VEGF-Dll4/Notch信号转导通路有关。     

人参皂苷Rg1对癫痫大鼠海马神经元损伤和小胶质细胞活化的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对癫痫大鼠海马神经元损伤和小胶质细胞活化的影响及其作用机制。方法 SD大鼠分为对照组(control组)、癫痫模型组(model组)、人参皂苷Rg1低剂量组(Rg1-L组)和人参皂苷剂量组(Rg1-H组),采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射制备癫痫大鼠模型;记录各组大鼠行为学发作情况;ELISA检测各组大鼠海马组织的氧化应激水平;qRT-PCR检测各组海马组织中炎症因子的表达;HE染色观察各组大鼠海马神经元结构和病理形态变化;免疫荧光组织化学染色检测各组大鼠小胶质细胞中iNOS、Arg-1蛋白表达。结果 model组大鼠症状达到Ⅲ级及Ⅲ级以上较control组显著增加,人参皂苷Rg1使大鼠的癫痫症状得到改善;与control组相比,model组大鼠海马组织中MDA(P<0.001)、TNF-αm RNA(P<0.001)、IL-1βmRNA(P<0.001)的表达水平上调,SOD(P<0.001)、IL-10 m RNA(P<0.001)的表达水平下调,而人参皂苷Rg1使大鼠海马组织中MDA(P<0.05)、TNF-αm RNA(P<0.05)、IL-1βmRNA(P<0.05)的表达水平下调,SOD(P<0.05)、IL-10 mRNA(P<0.05)的表达水平上调;model组大鼠海马神经元形态不完整,细胞间间隙增大和排列紊乱,人参皂苷Rg1组大鼠海马神经元形态明显改变,可见细胞排列较规则,大部分细胞形态正常;model组大鼠海马神经元凋亡率显著上升(P<0.001),人参皂苷Rg1组使大鼠海马神经元凋亡率下降(P<0.05);与control组相比,model组大鼠小胶质细胞数量显著增加(P<0.001),iNOS蛋白的表达显著升高(P<0.001),Arg-1蛋白表达显著降低(P<0.001),与model组相比,人参皂苷Rg1组大鼠小胶质细胞数量减少(P<0.05),iNOS蛋白的表达降低(P<0.05),Arg-1蛋白表达升高(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1降低癫痫大鼠海马组织中iNOS蛋白的表达,增加Arg-1蛋白的表达,抑制小胶质细胞的激活,减轻氧化应激和炎症因子的表达,降低癫痫大鼠发作的等级。     

FOXO3a蛋白在缺氧小鼠脑组织中的表达

目的:探讨叉头框蛋白O3a(FOXO3a)在缺氧小鼠大脑组织中的表达。方法:16只SPF级3月龄C57小鼠随机分为对照组(control)和缺氧组(hypoxia)。两组小鼠分别接受常氧浓度环境及低氧环境处理1 h,应用Western Blot法定量检测FOXO3a蛋白的表达水平;应用免疫荧光染色技术检测FOXO3a蛋白在脑组织中的表达分布。结果:与control组比较,应用Western Blot检测,发现缺氧后小鼠脑组织FOXO3a蛋白表达水平上调;免疫荧光检测显示缺氧小鼠的脑皮层、海马区中FOXO3a蛋白表达水平明显升高(P<0.01),其中神经元及星形胶质细胞的FOXO3a表达均明显升高(P<0.01)。结论:缺氧可导致小鼠脑皮层、海马区神经元及星形胶质细胞FOXO3a蛋白表达上调。     

ARNT调控低氧通路促进小鼠骨骼肌再生的实验研究

目的　探索芳香烃受体核转运子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT）对骨骼肌再生的调控作用,为提高老龄人口骨骼肌再生能力提供方向。 方法　构建小鼠骨骼肌冰冻损伤模型,观察幼龄鼠与老龄鼠、骨骼肌特异性ARNT基因敲除小鼠与野生鼠、加入低氧通路激活剂（ML228）与DMSO老龄鼠间骨骼肌再生能力差别;分析ARNT、低氧通路、肌再生因子表达含量及小鼠下肢血流差异。 结果　衰老导致骨骼肌再生能力减弱;敲除ARNT基因后,小鼠骨骼肌的再生能力显著下降,低氧通路因子及相关基因表达下调;ML228可使受损的骨骼肌再生能力得到恢复。 结论　衰老引起的ARNT含量下降抑制低氧通路是导致老龄骨骼肌再生能力降低的主要原因。低氧通路激活剂可改善受损骨骼肌的再生能力,有望成为药物重塑衰老骨骼肌再生能力的新靶点。