问号状钩端螺旋体外膜蛋白Loa22的克隆、表达及对豚鼠的免疫保护作用研究

目的构建问号状钩体强毒赖型56601株外膜蛋白Loa22的重组质粒,表达Loa22蛋白,研究该蛋白对豚鼠的保护作用。方法以问号状赖型钩体56601株基因组为模板扩增目的基因,将Loa22基因克隆至原核表达载体PQE-31,构建PQE31-Loa22重组体,将其转入大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。于0、2、4周将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下免疫豚鼠。每次剂量为蛋白50μg/只,末次免疫后2周,用培养3d的56601株钩体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1ml/只)。连续观察15d,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。结果成功扩增出Loa22基因,构建原核重组质粒PQE31-Loa22。重组质粒能在大肠杆菌M15中高效表达Loa22蛋白。用Loa22蛋白主动免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,结果显示无发病现象,而免疫对照组的豚鼠中出现了食欲不振、活动减少等现象,病理切片有明显改变。结论成功构建了Loa22重组原核表达质粒,表达纯化的蛋白可以使豚鼠抵抗同型钩体的攻击,免疫保护作用为82%。     

赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用

目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。     

复发性肝包虫病经完整外囊摘除和内囊摘除术后复发率的比较

目的:通过随访观察来对比肝包虫外膜内外囊完整摘除术与常规内囊摘除术在治疗复发性肝包虫后的复发率,来评价其临床应用价值.方法:对我院8年间(1999 年～2007年)再次入院的复发肝包虫病患者70例,将其分为两组:A组30例:保留外囊的传统术式组;B组40例:外膜内外囊完整摘除术(新术式).对临床观察指标原位复发率进行统计分析.随访时间中位数为36月(3月～96月).结果:外膜内完整外囊摘除术式组原位复发率低于传统术式(P<0.05).结论:外膜内完整外囊摘除术式能降低复发病例的再次手术复发率.     

外膜涂抹川芎嗪防治静脉移植物再狭窄的实验研究

目的 探讨术中局部应用川芎嗪对自体移植静脉再狭窄的影响及其作用机制.方法 建立家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型,随机分为两组:pluronic-F-127 gel组和川芎嗪组.pluronic-F-127 gel组在静脉移植物外膜涂抹pluronic-F-127 gel凝胶,川芎嗪组在静脉移植物外膜涂抹由pluronic-F-127 gel凝胶携带的川芎嗪.分别于术后3、7、14 d用免疫组织化学方法检测移植静脉壁的增殖细胞(BrDU阳性细胞)数,HE、Masson染色后应用计算机图像分析系统测量术后14 d移植静脉内膜厚度、中膜厚度及内膜厚度/中膜厚度(I/M).结果 术后14 d,川芎嗪组移植静脉内膜厚度、中膜厚度、I/M值均明显低于pluronic-F-127 gel组,分别减少68.35%、22.02%,54.48%,差异有统计学意义(P<0.05);术后3、7、14 d,川芎嗪组的细胞增殖指数均低于pluronic-F-127 gel组,分别减少约31.78%、41.03%、38.75%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 用pluronic-F-127 gel携带川芎嗪涂抹自体移植静脉外膜可使移植静脉内膜、中膜增生减轻,对静脉移植物早期再狭窄有良好的防治作用,其机制可能与川芎嗪作用于移植静脉外膜细胞靶点有关.     

问号钩端螺旋体致病物质及其作用机制研究进展

问号钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行最广的人兽共患病.由于问号钩体无外毒素,所含有的内毒素样物质也不能合理地解释其致病性,故问号钩体致病机制至今未明.近年国外学者分别报道了问号钩体内鞭毛、一些糖脂或糖肽类物质、溶血素、部分外膜蛋白分别与体外生存、侵袭力、粘附宿主细胞、细胞膜损伤、诱导炎症因子和细胞凋亡等有关,从而与问号钩体致病密切相关.研究资料还提示,问号钩体致病机制可能与传统的细菌主要以内、外毒素致病有明显差异.     

阿托伐他汀对自发性高血压大鼠去外膜颈动脉血管功能的影响

目的：观察阿托伐他汀对自发性高血压大鼠（SHR）去外膜后血管阻力及对去甲肾上腺素（NE）的收缩性的影响。方法：36只16周龄雄性SHR去除一侧颈动脉外膜后，随机分为3组：阿托伐他汀组、缬沙坦组、SHR对照组，分别给药4、8周分两次处死。给药前及给药后每2周测量大鼠尾动脉SBP；测定双侧颈动脉血流量和血管张力。结果：给药4周时，阿托伐他汀组SBP下降，至6、8周时较SHR对照组显著下降（P〈0．05，P〈0．01）；去外膜侧早期血管阻力指数轻度降低，至8周时则大于正常侧；而阿托伐他汀组和缬沙坦组血管阻力指数均较SHR对照组显著减小（P〈0．05，P〈0．01）。去外膜侧颈动脉对NE的收缩反应在4周和8周时均显著低于正常对照侧（P〈0．01）；4周时阿托伐他汀组较SHR对照组显著增加双侧颈动脉对NE的最大收缩反应（P〈0．05），而8周时较SHR对照组减小。结论：去外膜后早期SHR血管阻力轻度下降，但后期高于正常侧，而阿托伐他汀可显著降低SHR的血管阻力，包括未去外膜血管。去外膜后，SHR的颈动脉环对NE的收缩性显著低于正常对照侧血管。早期阿托伐他汀可提高去外膜血管对NE的收缩反应，但至后期则可降低其对NE的收缩性。     

淋球菌外膜蛋白Porin I多抗的黏附抑制作用研究

目的:研究兔抗淋球菌外膜蛋白Porin I(P I)的多克隆抗体阻断淋病奈瑟菌对泌尿生殖道上皮的黏附作用。方法:将自行构建表达的淋球菌GST-P I融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得兔抗P I蛋白的多抗血清,纯化后得到P I-IgG抗体。建立淋球菌感染BALB/c小鼠模型,并通过观察阴道黏膜改变、分泌物涂片、冲洗液培养及阴道组织病理变化评价兔抗P I-IgG抗体对淋球菌黏附的影响。结果:经1 m g/m l兔抗P I-IgG处理后3 h再接种淋球菌的BALB/c小鼠生殖道黏膜未见红肿及脓液,分泌物涂片及阴道冲洗液未检及淋球菌,阴道组织病理检查也未见炎症细胞浸润。而低于浓度1 m g/m l及长于3 h兔抗P I-IgG处理的小鼠阴道组织病理可检及炎症细胞,但其它检查结果阴性。结论:纯化的抗淋球菌GST-P I融合蛋白的多克隆抗体,能有效抑制淋病奈瑟菌对小鼠泌尿生殖道上皮的黏附与感染,阻断作用及持续时间与抗体浓度有关。     

肝包虫外膜内完整摘除术适应症初探

目的 :探讨“肝包虫外膜内完整摘除术”的手术适应症。方法 :对我院同期收治的 6 7例肝包虫病患者手术情况进行回顾性分析 ,探讨不同情况的肝包虫囊肿使用该手术的可行性、安全性。结果 :6 2例成功实施了“肝包虫外膜内完整摘除术” ,同期 5例失败。结论 :在开展该术式初期 ,其适应症的提出应当相对保守。较为适合的适应症应为 :①患者一般情况良好 ;②肝脏单发或多发细粒棘球蚴病 ;③外囊与肝组织或肝门主要血管或胆管存在可分离间隙 ;④未破入较大胆管 ;⑤患侧肝脏可充分游离     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

钩端螺旋体Lipl21基因真核质粒构建及在HeLa细胞的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据. 方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21转染入HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达. 结果双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变.重组质粒pcDNA3.1（＋）/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21. 结论成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/Lipl21,且能够在体外真核细胞中表达,为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础.