mRNA差异显示PCR技术在妇科肿瘤研究中应用

mRNA差异显示技术(differential display-PCR,DD-PCR)是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法,可以比较多种样本间不同表达的基因.因该方法简便、敏感、可重复性强等特点,已成为研究肿瘤分子生物学基础的良好工具.综述DD-PCR技术在妇科肿瘤发生发展、耐药及转移机制研究中的应用.     

基因功能研究策略

美国塞莱拉遗传信息公司通过人类基因组计划，于2001年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志上联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱。基因组计划完成后，新的难题摆在了科学家的面前，那就是基因功能的研究以及怎样提高基因功能研究的效率等问题。对于一种基因，阐明基因的结构与生物学功能、基因的结构与生物学和临床医学之间的相互关系以及新基因表达调节的机制，是目前基因的分子生物学研究领域中最具挑战性的工作。当前主要采用以下技术。     

c-jun反义核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的:观察反义c-jun核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法:选择20只SD大鼠,等分为实验组和对照组,均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术,实验组移植静脉周围和血管吻合口周围应用反义c-jun核酸凝胶涂布;对照组仅行凝胶涂布。术后周取出移植血管,分2别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度,内膜平滑肌细胞数及增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、脱氧核糖核酸和α-肌动蛋白等反映血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)增殖情况和表型转换的指标的表达情况。结果:移植静脉术后动脉化,管壁增厚,但转染c-jun反义核酸组移植血管内膜厚度(实验组和对照组均数差值为-20.7170,P<0.01)及VSMC实验组和对照组比较t值为-13.011,P<0.01)(增殖均较对照组减少,PCNA(实验组和对照组均数差值为-19.2310,P<0.01)和DNA(实验组和对照组比较值为F55.000,P<0.01)阳性表达情况亦较对照组明显减少,α-肌动蛋白的表达较对照组升高(实验组和对照组比较q值为5.503,P<0.01)。结论:反义c-jun核酸可抑制VSMC的表型转化及细胞分裂而减少VSMC的增殖,从而有效的抑制移植静脉内膜的过度增生。     

PCBP1:一种在多水平上参与基因表达调控的蛋白因子

多聚胞嘧啶结合蛋白1 (poly C binding protein-1,PCBP1),属于RNA结合蛋白亚家族,因其具有同RNA的多聚胞嘧啶(poly C)区域特异的结合活性而得名.目前该亚家族共有5个成员:hnRNP K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)、PCBP1、PCBP2、PCBP3和PCBP4.PCBP1蛋白在多个水平参与基因的表达调控,如转录、mRNA加工、mRNA的转运、mRNA稳定以及翻译水平调控等.本文对PCBP1基因的结构和生物学功能进行了综述.     

反义DNA和RNA：治疗病毒感染的新策略（下）

2．2siRNA的化学修饰siRNA的基因沉默效率还依赖于它的稳定性。未修饰的双链RNA比单链RNA更稳定，使用化学修饰的碱基合成siENA可进一步提高其稳定性和延长其抑制效应。广泛使用的化学修饰通常为核糖的2’位置，包括2’-O-甲基核糖、2’-O-丙烯基核糖、2’-脱氧尿苷、2’-氟2’脱氧尿苷、2’-氟2’-脱氧胞苷酸等。同义和／或反义链2’核糖位置完全替代的的siRNA分子不能诱导RNAi，然而3’突出部分或碱基配对部位的2’核糖修饰增强其在血浆中的稳定性同时不丧失活性。另一个常被修饰的是主链部分。有几项研究提示具有磷硫酰主链的siRNAs活性增强，但随修饰程度的增加活性反而下降。主链修饰还可将磷酸二酯键中的非共价氧被等电子的甲硼烷替代，这种甲硼磷酸化修饰的siRNAs比天然siRNAs更有效，与硫代修饰siRNAs相比抵抗核酶降解能力更强而毒性更低。有研究表明恰当化学修饰的siRNAs稳定性好、能与靶位更有效结合，改善其药代动力学特性的同时却不影响其内在效能。[第一段]     

促肝细胞再生磷酸酶-3基因在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的检测促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)mRNA在结直肠癌(CRC)中的表达,探讨其与CRC发生发展以及侵袭转移的关系。方法半定量PCR测定46例CRC组织及其对应正常黏膜、6例结直肠腺瘤(CRA)及其对应正常黏膜以及18例淋巴结和肝转移灶中PRL-3mRNA相对表达水平,并分析其表达水平与临床病理学指标的关系。单链多态性分析法(PCR-SSCP)检测基因突变情况。结果46例CRC中PRL-3基因表达量较相应正常黏膜组织高,差异有统计学意义(1.6±0.7比0.4±0.1,P<0.01);6例结直肠腺瘤组织与对应的正常黏膜中PRL-3mRNA表达量差异无统计学意义(0.6±0.3比0.5±0.2,P>0.05);12例淋巴结转移灶和6例肝转移灶PRL-3基因表达量分别为2.1±0.8和3.3±1.0,显著高于原发癌肿、正常黏膜、阴性淋巴结组织中的表达(P<0.01)。PRL-3基因表达水平与CRCDukes分期、浸润深度、淋巴结和远处转移有关(P<0.05),与性别、肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05)。PCR-SSCP分析发现,6例肝转移灶中有1例出现异常泳动条带。结论PRL-3基因在CRC的发生发展和侵袭转移中起重要作用,其作用可能是通过基因表达上调和基因突变共同实现的。     

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

实时荧光RT-PCR定量检测前列腺癌组织中AMACR基因表达

目的 建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测AMACR mRNA的方法学并检测其在前列腺癌(PCa)组织中的表达.方法 在AMACR基因的2、3外显子之间设计一对引物及MGB探针,将PCR扩增产物与pMD18-T载体连接,构建重组质粒作为定量检测的标准品,建立实时荧光定量RT-PCR方法,然后对32例PCa、60例良性前列腺增生(BPH)及34例其它肿瘤组织进行AMACR mRNA的定量检测.结果 重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明克隆成功,该方法灵敏度高,线性范围为5～5×108copies/reaction.AMACR mRNA在PCa组织中表达量显著高于BPH组织(P<0.01)及其他类型肿瘤组(P<0.01).ROC曲线分析结果显示,曲线下面积(AUC-ROC)为0.890,AMACR mRNA诊断前列腺癌的敏感度和特异度分别为81.3%和86.7%.PCa组织中AMACR mRNA表达量及检测阳性率与不同临床分期和病理分级之间的差异尚不具有统计学意义(P值均>0.05).结论 实时荧光定量RT-PCR检测AMACR mRNA的方法具有敏感、特异、准确、重复性好等特点.AMACR mRNA在前列腺组织中的表达对PCa的诊断具有一定的临床应用价值.     

纳米粒子载体携带反义转化生长因子-β1基因的局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的探讨纳米粒子携带反义转化生长因子(TGF-)β1局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法45只大鼠制成自体静脉移植模型后,分成纳米粒子DNA组、纳米粒子空载体组和生理盐水对照组,进行局部定位转染,2周后观察移植静脉内膜的变化,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Westernblot以及免疫组织化学等方法检测反义基因对内源性TG-Fβ1表达的影响。结果基因转染后两周,内膜厚度为(20.5±4.7)μm,明显小于两个对照组(P<0.01)。RTPCR和Westernblot结果表明,基因转染组的TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显低于空载体组及生理盐水对照组。结论纳米粒子可有效地作为基因的转移载体;纳米粒子携带反义TGF-β1可以减少内源性TGF-β1基因的表达,抑制细胞外基质(ECM)的合成,从而达到抑制内膜增生的目的。