Silencing the expression and function of breast cancer resistance protein in MCF-7/MX100 cells by shRNA expressing lentivirus

Overexpression of breast cancer resistance protein (ABCG2/BCRP) in cancer cells may cause tumor resistance to chemotherapeutic drugs. RNA interference (RNAi) can selectively silence the expression of a target gene of interest. In the present study, we aimed to modulate the BCRP expression and examine the functional consequence using RNAi approach. Three siRNAs (si-BCRP1, si-BCRP2 and si-BCRP3) targeting BCRP were evaluated in drug-resistant MCF-7/MX100 cells overexpressing BCRP. The BCRP expression at the mRNA and protein levels was inhibited by si-BCRP2 and si-BCRP3 over 90% and 70%, respectively. As a result, the intracellular mitoxantrone accumulation was sharply increased in MCF-7/MX100 cells after the transfection. Furthermore, shRNA sequences bearing si-BCRP2 and siBCRP3 were cloned into lentiviral expression plasmid (pTRIPZ) to package lentivirus, and MCF-7/MX100 cells stably expressing siRNA targeted to human ABCG2/BCRP were established by lentivector-mediated gene transfer system. The stable cells exhibited an increased miotxantrone accumulation, among which the BCRP expression at the mRNA level was reduced by Lenti-BCRP2 and Lenti-BCRP3 around 72% and 56%, respectively. Moreover, the BCRP expression at the protein level was reduced by 70% and 53%, respectively. Furthermore, the cell lines were used to screen active ingredients in traditional herbal medicines in order to evaluate BCRP substrates or inhibitors. Our data suggested that the BCRP knockdown cell lines could serve as good cell models for preclinical studies.     

LIM矿化蛋白1过表达对骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖的影响

目的　探讨骨肉瘤细胞系OS-9901细胞中LIM矿化蛋白1（LMP-1）过表达对该细胞增殖的影响。 方法　构建LMP-1过表达慢病毒载体,通过脂质体转染进骨肉瘤细胞系OS-9901细胞。通过荧光定量PCR和Western blot检测LMP-1过表达情况,并通过BrdU掺入实验比较LMP-1过表达前后细胞增殖情况。 结果　转染了LMP-1过表达慢病毒载体6 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达均无显著变化（P>0.05）,且DNA合成量无显著变化。而当LMP-1过表达慢病毒载体转染细胞12、24和48 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达量均显著提高的同时,DNA合成量显著降低（P<0.05）。 结论　LMP-1过表达可抑制骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖。     

小鼠白细胞介素15慢病毒载体的构建和表达

目的：克隆小鼠白细胞介素15（IL-15）基因,并构建可表达小鼠IL-15基因的重组慢病毒。方法：根据小鼠IL-15基因序列以及慢病毒穿梭载体相应的酶切位点设计合成PCR引物;提取小鼠脾脏总RNA,逆转录PCR扩增小鼠IL-15基因的编码区;克隆小鼠IL-15基因的编码区,并进行基因测序;构建含有IL-15基因的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起感染293T细胞;获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG,Western Blot检测IL-15基因在MEG细胞中的表达。结果：含有小鼠IL-15基因编码区的慢病毒穿梭质粒构建成功,基因测序结果完全正确;含有小鼠IL-15基因的慢病毒载体包装成功;所得病毒上清可成功感染MEG细胞,流式细胞术检测阳性率可达98%;Western Blot结果证明小鼠IL-15基因在MEG细胞中正常表达。结论：成功扩增、克隆了小鼠IL-15基因,并建立其慢病毒表达系统,从而为后续的基础及应用研究工作奠定了基础。     

慢病毒载体介导2次转基因对人胚胎干细胞特性的影响

目的： 研究2次转基因对人胚胎干细胞（hESCs）多能分化特点和保持自我更新能力的影响。方法：构建携带非转录因子外源基因细胞毒性T细胞相关分子4免疫球蛋白 (CTLA4Ig) 、吲哚胺2,3双氧化酶（IDO）和荧光素酶的慢病毒载体,在hESCs先转导外源基因CTLA4Ig或IDO,完成筛选后转导外源基因荧光素酶。检测hESCs中外源基因的表达和功能,免疫组化和RT-PCR以及流式细胞仪方法检测hESCs细胞表面标记物、类胚体（EB）形成和体内畸胎瘤形成能力。结果：转导的外源基因均能表达并表现相应的功能。2次转导慢病毒载体后hESCs细胞表面标记物肿瘤排斥抗原（Tra-1-60） 和Octomer转录因子-4（OCT-4）染色仍为阳性,能形成EB,RT-PCR检测到甲胎蛋白(AFP)、配对盒基因6（Pax6）和MSI1的表达,异种移植后荧光信号逐渐增强。结论：利用慢病毒2次转导非转录因子外源基因不影响hESCs的未分化状态和多能分化能力,这对hESCs的转基因研究具有借鉴价值。     

结肠癌细胞HIF-1α及MDR1 miRNA重组慢病毒干扰体系多药耐药研究

目的 研究HIF-1α及MDR1 miRNA重组慢病毒干扰体系的多药耐药性.方法 收集结肠癌切除的标本60例,用福尔马林(10％)浸泡,制成蜡块存档标本.通过观察HIF-1α与P-gp的表达和分布情况,找出二者关联.并构建miRAN干扰体系,研究重组慢病毒干扰体系和结肠癌细胞多药耐药的关系.结果 HIF-1α的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的位置以及肿瘤分化的程度无关(p＞0.05),而与Dukes分期、淋巴结转移有关.HIF-tα表达与P-gp的表达呈显著正相关(γ=0.613,P＜0.05).LoVo细胞对ADR、VCR及5-Fu的敏感性均有不同程度的恢复,但沉默HIF-1α前后并无统计学差异(P＞0.05),沉默MDR1基因后,LoVo细胞对ADR与VCR的耐药性有所逆转,沉默MDR1基因表达对二者化疗敏感性变化无明显影响.结论 HIF-1α与P-gp的表达不受患者的性别、年龄、肿瘤位置、分化程度的影响,HIF-1α表达与P-gp的表达呈显著正相关,说明HIF-1α通过与MDR1/P-gp的相互作用最终参与了结肠癌多药耐药的发生.     

人血管生成素1基因慢病毒表达载体的构建及其在脐带间充质干细胞的表达

目的 通过基因重组技术构建人血管生成素-1(Ang-1)基因慢病毒表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的表达及对hUC-MSCs免疫抑制能力的影响。 方法 应用Trizol法从hUC-MSCs提取总RNA,反转录获取cDNA,PCR扩增获得编码Ang-1的序列克隆到GV287载体中。将重组GV287-Ang-1载体质粒和慢病毒包装质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,收集病毒上清,纯化浓缩测定病毒滴度。采用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting法检测Ang-1蛋白表达,并通过CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖活性。 结果 Ang-1基因扩增PCR产物与预期大小一致。重组慢病毒GV287-Ang-1质粒经PCR和DNA测序分析显示,所得结果与目的基因序列一致且插入方向正确。包装慢病毒浓缩悬液滴度为2×10⁸TU/mL,最佳感染复数为8。GV287-Ang-1转染组细胞Ang-1表达显著高于未转染组和GV287转染组。过表达Ang-1的hUC-MSCs对T淋巴细胞的增殖抑制显著高于单纯的hUC-MSCs。 结论 成功构建携带Ang-1基因的慢病毒载体GV287-Ang-1,并可有效转染hUC-MSCs过表达Ang-1蛋白,且能显著提高hUC-MSCs的免疫抑制能力。     

生长分化因子15基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）基因过表达慢病毒载体。 方法 根据GDF15 mRNA的基因序列,合成GDF15基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞,再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞,包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T细胞,再用Western blot检测GDF15的表达情况。 结果 测序结果证实GDF15 基因正确插入载体中。慢病毒转染293T细胞后,GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。 结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功,并有效增强GDF15基因在293T细胞中的表达。     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

Selective elimination of HIV-1-infected cells by Env-directed, HIV-1-based virus-like particles

We recently showed that both replicating and resting cells cultivated with ganciclovir (GCV) were killed when challenged with vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped HIV-1-based virus-like particles (VLPs) carrying the Nef7 (i.e., an HIV-1 Nef mutant incorporating in virions at high levels)/herpes simplex virus-1 thymidine kinase (HSV-TK) fusion product. On this basis, a novel anti-HIV therapeutic approach based on Nef7/TK VLPs expressing X4 or R5 HIV cell receptor complexes has been attempted. We here report that (CD4-CXCR4) and (CD4-CCR5) Nef7-based VLPs efficiently enter cells infected by X4- or R5-tropic HIV-1 strains, respectively. Importantly, the delivery of the VLP-associated Nef7/TK led to cell death upon GCV treatment. Of interest, VLPs were effective also against non-replicating, HIV-1-infected primary human monocyte-derived macrophages. HIV-targeted VLPs represent a promising candidate for the treatment of persistently HIV-1-infected cells that are part of virus reservoirs resistant to HAART therapies.