脐带间充质干细胞对角膜内皮细胞增殖能力的影响

目的:探讨并优化人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;观察兔角膜内皮细胞(cornea endothelial cells,CEC)与hUCMSCs共培养后增殖能力及细胞周期的变化.方法:用酶消化法体外分离培养hUCMSCs,流式细胞仪检测hUCMSCs免疫表型:将CEC分别与hUCMSCs、兔角膜基质细胞在Transwell体系中共培养,通过流式细胞术观察内皮细胞增殖能力及细胞周期的变化.结果:采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24 h,贴壁细胞形态多为长梭形、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.流式细胞仪分析第3代细胞均表达CD29、CD44、CD105,不表达造血干细胞标记CD34、CD45和HLA-DR.与空白对照组CEC周期比较脐带间充质干细胞组与基质细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例增加.G1期细胞比例下降,干细胞组增加幅度高于基质细胞组.干细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例比空白对照组的平均增加近17%,增殖能力显著提高.结论:经鉴定用酶消化法体外能成功分离培养出hUCMSCs,将其与CEC共培养能促进CEC增殖.     

脂肪干细胞诱导神经干细胞分化的体外实验研究

目的研究脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法从新生BALB／c小鼠中分别分离获得ADSCs及NSCs,进行体外培养和传代。构建ADSCs与NSCs共培养体系,以单纯NSCs组为对照,进行ADSCs诱导分化研究。共培养4、8、12d后行神经元特异性神经丝200免疫组化鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率。结果共培养后8—12d,可见大量成熟神经元,大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突。共培养组NSCs分化为神经元的百分率大约为21％,而单纯NSCs培养组约为4％。共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异（P〈0．05）。结论ADSCs在体外能够促进NSCs向神经元转化。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSC）对大鼠脑胶质瘤C6细胞增殖的影响,并且探讨其相关机制。方法提取SD大鼠BMSC,进行体外培养、扩增。应用MTt比色法检测不同浓度BMSC上清液对C6细胞系增殖的抑制作用。用Transwell小室将BMSC与C6细胞进行双层培养,以HE染色法检测C6细胞形态变化。用划痕实验检测细胞迁移情况。结果MTF结果显示BMSC上清液对C6细胞有抑制作用,120h后1：8、1：4、1：2的BMSC上清稀释液、BMSC上清原液培养组的生长抑率分别为17．1％、26．0％、39．9％、43．1％;与BMSC进行双层培养后的C6细胞其形态发生了明显改变,由圆形或多角形变为长梭形,细胞包体伸出长突起;划痕实验显示在36h时对照组迁移率为100％,划痕完全愈合,而BMSC上清组划痕未见全愈合,迁移率为82％。结论①BMSC上清液能抑制胶质瘤C6细胞的恶性增殖,而且抑制效应呈剂量依赖性;②BMSC对C6的运动和迁移产生了抑制作用,从而降低了其恶性侵袭程度。     

杜仲叶β-谷甾醇对成骨细胞和卵巢颗粒细胞的影响

目的研究杜仲叶β-谷甾醇(β-sitosterol)对骨代谢平衡的调控作用及其机制。方法采用溶剂法、柱层析与重结晶等技术从杜仲叶提取部位Ⅰ中分离得到白色针状晶体B,根据理化性质和光谱分析鉴定化学结构为β-谷甾醇;建立体外大鼠成骨细胞、卵巢颗粒细胞单独培养与混合培养模型,研究杜仲叶β-谷甾醇对骨代谢平衡的调节作用。结果杜仲叶β-谷甾醇可明显促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇E2,有效提高成骨细胞护骨素与破骨细胞分化因子的比值(OPG/ODF),是调节骨代谢平衡的机制之一。结论杜仲叶β-谷甾醇通过提高成骨细胞OPG/ODF比值和刺激卵巢颗粒细胞分化E2,从而促进和加强成骨作用。     

原代培养人肺癌相关成纤维细胞对肺癌细胞放射敏感性影响研究

目的 探讨在体外直接接触共培养条件下人肺癌相关成纤维细胞(CAF)对肺癌细胞系放射敏感性的影响。方法 采用人肺癌组织进行原代培养后获取人肺CAF,采用免疫荧光技术鉴定。CAF与肺癌细胞系A₅₄₉、H₁₂₉₉进行直接接触共培养,采用细胞克隆形成实验观察其对肺癌细胞系放射敏感性的影响。结果 新鲜人肺腺癌经组织块贴壁法原代培养出可稳定传代的CAF,其特异表达α-平滑肌肌动蛋白、波行蛋白和成纤维细胞活化蛋白,而无细胞角质蛋白-18表达。在0 Gy照射时单独组和共培养组A₅₄₉细胞的克隆形成率分别为(20.0±3.9)%和(32.3±5.5)%(P<0.05),H₁₂₉₉细胞的分别为(20.6±3.1)%和(35.2±2.3)%(P<0.05)。单独组和共培养组A₅₄₉细胞的SF₂分别为0.727±0.061和0.782±0.089(P>0.05),H₁₂₉₉细胞分别为0.692±0.065和0.782±0.037(P>0.05);人肺CAF对A₅₄₉、H₁₂₉₉细胞的放射保护增益比分别为1.29和1.25。结论 人肺CAF与肺癌细胞系直接接触共培养后使肺癌细胞放射敏感性降低,原因可能为CAF促进了肿瘤细胞增殖。     

Co-culture of mouse spermatogonial stem cells with sertoli cell as a feeder layer,stimulates the proliferation and spermatogonial stemness profile

Objectives

Sertoli cells effect the fate map of spermatogonial stem cells (SSCs) to self-renew via providing the special microenvironments. Maintenance of proliferation and self-renewal activity of SSCs may be usable as a therapeutic strategy, leads to increase the recovery of male fertility. This research was aimed to evaluate the effect of mouse sertoli cells on spermatogonia stem cells proliferation and the expression pattern of stemness markers.

DFMG 调节 TLR-4抑制损伤内皮细胞对平滑肌细胞增殖和迁移促进作用

目的：观察7-二氟亚甲基-5,4-二甲氧基异黄酮（DFMG）是否能干预损伤内皮细胞对平滑肌细胞增殖和迁移的促进作用,且其干预过程是否与 TLR4信号通路相关。方法：采用 CCK-8法和 Transwell 迁移法测定LPC 诱导的内皮细胞的损伤对平滑肌细胞的增殖和迁移的影响。采用 Western blot 和荧光定量 PCR 测定损伤共培养体系中的内皮细胞 TLR4在蛋白水平和基因水平的表达。运用 TLR4特异性激动剂（LPS）和特异性的抑制剂（CLI095）,采用 CCK8法和 Transwell 迁移法测定损伤共培养体系中平滑肌细胞的增殖能力和迁移能力。结果：①随着 LPC 浓度的增加,LPC 诱导的内皮细胞损伤引起平滑肌细胞的增殖和迁移的效应增强,并且选取30μM 的LPC 作用于内皮细胞并与平滑肌细胞共培养作为实验的损伤共培养模型。②经光密度值分析,LPC 组的内皮细胞TLR4的表达量是对照组的2倍;经荧光定量 PCR 分析,LPC 组的内皮细胞 TLR4的表达量是对照组的2.414倍。③相比,损伤组和 LPS 组的平滑肌细胞的增殖和迁移能力较对照组更强;相比,CLI095组和 DFMG 组的平滑肌细胞的增殖和迁移能力较损伤组更弱。结论：LPC 诱导的内皮细胞的损伤可以引起平滑肌细胞的增殖和迁移,而DFMG 可能是通过抑制 TLR4信号阻碍损伤的内皮细胞对平滑肌细胞增殖和迁移的促进作用。     

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10（CPN10）对成骨细胞（OB）-外周血单个核细胞（PBMs）共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10（10μg/ml）处理组。主要观察指标：①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG 相对浓度分别为33.4798±177;2.0929、47.974±177;5.1628、47.0861±177;2.2033、7.4642±177;0.6791（P〈0.05）,对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞（OB-PBMs）共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。     

基于转录组测序分析骨髓间充质干细胞对子宫内膜癌细胞的影响

目的 探索骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）对子宫内膜癌Ishikawa细胞转录水平的影响。方法 用Lenti-EGFP慢病毒感染Ishikawa细胞,分别将表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的Ishikawa细胞单独培养、与BMSCs接触共培养;通过流式细胞术分离Ishikawa细胞,并进行转录组测序分析筛选差异表达的mRNA和miRNA,通过miRWalk预测差异miRNA靶基因,对两者的交集基因进行GO、KEGG、蛋白网络互作分析;采用qRT-PCR和Western blot验证测序结果的准确性。结果 标记EGFP的Ishikawa细胞与BMSCs共培养后,分离出的Ishikawa-EGFP阳性细胞占33.6%,阴性细胞占10.5%。测序后共筛选出5 928个差异表达mRNA和111个差异表达miRNA。蛋白网络互作分析显示交集基因表达的蛋白之间相互作用,核心节点包括CDKN1A、JAK1、COL1A1、VCAN等。miRNA-mRNA网络图显示CDKN1A与hsa-let-7e-5p存在潜在靶向关系。GO分析和KEGG分析结果显示,其交集基因参与细胞外基质结构、细胞黏附分子结合等,并主要富集在PI3K-Akt、黏着斑、MAPK、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等信号通路。qRT-PCR和Western blot结果显示,共培养后Ishikawa-EGFP细胞中CDKN1A表达上调,hsa-let-7e-5p表达下调。结论 BMSCs可能通过细胞间的相互作用调节肿瘤局部微环境并促进子宫内膜癌的发生发展。