大鼠软骨细胞与兔软骨细胞的培养与比较

目的 体外分离培养大鼠及兔膝关节软骨细胞,观察并比较两种软骨细胞的培养特点。方法 采用机械-酶消化法处理SD大鼠幼鼠和新西兰兔的软骨组织,传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数法测定生长曲线,实时定量PCR测定不同代数的软骨细胞Ⅱ型胶原与含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5）表达水平,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果 原代培养大鼠软骨细胞12 h,内贴壁成多角形或不规则型,排列成“铺路石”状,培养3~5 d后进入快速增殖期,1周后进行细胞传代培养。兔软骨细胞相对贴壁缓慢,生长滞后。两类软骨细胞随着培养代数的增加,Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量逐渐减少,ADAMTS5的表达逐代升高,表明随着培养代数的增加,软骨细胞活力逐渐下降。相同代数的大鼠软骨细胞活性较兔软骨细胞更高。甲苯胺蓝染色可见大鼠软骨细胞内成蓝色异染的糖胺多糖成分。不同波段的荧光激发下,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色可见大鼠原代培养的软骨细胞胞浆和胞膜呈清晰的绿色荧光,兔软骨细胞呈红色荧光,细胞核为明亮的蓝色荧光。结论 本实验通过比较大鼠及新西兰兔软骨细胞的培养与特点,证实随培养代数增加,软骨细胞活性逐渐降低,且相同代数大鼠软骨细胞较兔软骨细胞具备更高活性。     

自噬在张力诱导终板软骨细胞退变过程中的变化

 目的 探讨自噬在张力诱导终板软骨细胞退变过程中的变化及作用。方法 取10只清洁级SD大鼠腰椎终板软骨进行细胞培养。对P1代终板软骨细胞分别加载间歇循环张力（10%伸长率,0.5 Hz）0 h、3 h、12 h、24 h、48 h。以倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,实时PCR与蛋白印迹法检测软骨标志基因Ⅱ型胶原、转录因子SOX-9及蛋白多糖转录因子、Beclin-1和LC3基因表达的变化,以单丹磺酰戊二胺染色观察自噬小体。MTT（3-2,5-二苯基四氮唑溴盐染色）法检测3-甲基腺嘌呤（自噬抑制剂）刺激前后的细胞存活率。结果 间歇循环张力诱导后0 h组与3 h组为正常终板软骨细胞形态,呈多角形;12 h组略呈不规则形;24 h组和48 h组呈梭形改变。实时PCR显示24 h组和48 h组中Ⅱ型胶原、转录因子SOX-9及蛋白多糖的表达量降低;自噬相关基因LC3和Beclin-1表达量呈时间依赖性增加。单丹磺酰戊二胺染色显示24 h组和48 h组自噬发生率呈时间依赖性增加。MTT结果显示细胞存活率呈降低趋势;添加3-甲基腺嘌呤刺激后细胞活性减弱、存活率降低。结论 间歇循环张力刺激下终板软骨细胞表型逐渐丧失;自噬相关基因LC3与Beclin-1表达明显上调,但细胞活性降低;抑制自噬水平可降低细胞存活率,提示自噬参与了间歇循环张力诱导的终板软骨细胞退变过程。     

人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。     

Effect of different solvents and crosslinkers on cytocompatibility of Type II collagen scaffolds for chondrocyte seeding

Type II collagen extracted from porcine costal cartilage was evaluated as scaffolds for cartilage tissue engineering. Chemical crosslinkers were employed to improve the mechanical properties and the resistance toward degradation. Films and porous scaffolds were prepared from collagen solutions dissolved in 3% acetic acid (designated A) or in deionized water (designated W) and crosslinked by an epoxy (designated E) or by a carbodiimide (designated C). Immortalized rat chondrocytes and rabbit chondrocytes were used to assess cytocompatibility of crosslinked collagen matrices. Cell adhesion rate onto the films made by different preparations ranked in the order of WE > or = WC > AC > or = AE. Cell proliferation ranked in the order of AC > WC > AE > or = WE. Cells maintained round morphology only on AC and WC films. In 3-D seeding, AC scaffolds also were found to be the most cytocompatible. WC scaffolds, however, had better dimensional stability. It was concluded that Type II collagen scaffolds, when prepared by using deionized water as the solvent and carbodiimide as the crosslinker, could promote chondrocyte growth and matrix production.     

自体组织工程化纤维软骨修复半月板缺损的实验研究

目的：应用组织工程方法在具完全免疫功能的哺乳动物体内修复半月板缺损。方法：15只45日龄的长枫杂交仔猪为实验动物,以改良的Klagsbrun酶消化法从左膝半月板获得的自体纤维软骨细胞在体外扩增至一定数量,在右膝内侧副韧带前方的内侧半月板造成长1cm的全层缺损,分别将复合聚羟基乙酸（PGA）－纤维软骨细胞－Pluronic复合物,纤维软骨细胞－Pluronic复合物和单纯PGA植入缺损,以正常半月板和旷置缺损作为对照,分9,16和25周取材,标本采用大体观察,组织学,生物化学和生物力学作为评估指标。结果：PGA－细胞－Pluronic复合物在大体形态,组织学结构和压弹性模量（25周为正常组的59．7％）方面均显示形成了最佳的修复组织,并使对应股骨髁软骨的糖氨聚糖含量（25周为正常组的74．5％）保持相对稳定。结论：自体组织工程化纤维软骨能够修复乃至再造半月板,并且可以防止膝关节的创伤性退变。     

兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡调控基因的研究

目的:观察凋亡调控基因bcl-2在骨关节炎(OA)关节软骨中的表达,试图探讨bcl-2在OA发病中的作用机制。方法:参照Hulth的造模方法于无菌条件下,以健康青紫兰家兔左侧膝关节制作OA动物模型,并以右侧膝关节作为正常对照,应用免疫组织化学方法对第8周兔膝关节软骨中bcl-2进行检测。结果:OA组关节软骨bcl-2的阳性表达强度显著高于正常组,主要分布于关节软骨的浅层和中层,但OA组关节软骨深层胶原化区中bcl-2表达无明显变化。结论:OA组关节软骨细胞凋亡调控基因bcl-2表达较正常对照组明显增强,因此bcl-2的调节作用可能是OA病理过程进展缓慢的一个重要原因。     

循环应力对构建组织工程软骨的影响

目的 探讨循环应力对体外构建组织工程软骨的影响。方法 分离兔关节软骨细胞，体外扩增培养后种植于PGA无纺网支架上。实验组在循环应力下培养（0-200kPa，0．1Hz），对照组静态培养。实验组和对照组均培养4周。4周后取出组织工程软骨行大体标本观察。组织化学和免疫组织化学染色观察组织工程软骨结构以及Ⅱ型胶原分泌情况。结果 体外培养4周时，实验组的组织工程软骨形态和色泽更加接近正常透明软骨，厚度和组织弹性优于对照组，实验组的软骨细胞数量和细胞外基质合成明显增加，分泌Ⅱ型胶原能力更强。结论 循环应力刺激软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原增加，有利于在体外构建组织工程软骨。