参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响

目的：观察参麦注射液对急性缺氧-复氧后心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。 方法： 采用原代培养的大鼠心肌细胞，通过化学缺氧法使细胞缺氧5 min，再恢复氧供应15 min，复制心肌细胞缺氧-复氧（anoxia-reoxygenation, A/R）模型。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡百分率；Fluo-3负载激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子水平。 结果： A/R组心肌细胞凋亡百分率明显高于正常组，细胞内平均钙离子荧光强度也显著强于正常组（P<0.01）。参麦注射液组细胞凋亡率显著小于A/R组，同时细胞内钙超载也明显轻于A/R组（P<0.01）。 结论： 参麦注射液能有效抑制缺氧-复氧心肌细胞的凋亡，这种保护作用的机制之一可能是通过减轻细胞内Ca2+超负荷实现的。     

高功率脉冲微波和电磁脉冲辐照对心肌细胞膜电穿孔效应及机理的研究

电磁辐射可造成人体多器官系统的损伤。对其损伤的病理机制至今尚未完全阐明。心脏是电磁辐射损伤的敏感器官之一。本实验拟通过研究HPPM和EMP对心肌细胞的影响,探讨电磁辐射致伤的关键机制,解释脉冲电磁场致心肌细胞损伤的发展规律。本实验采用HPPM和EMP辐照原代培养心肌细胞的方法,用原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪和全自动生化检测仪等多种实验手段,检测辐照对细胞膜形态、结构和功能的影响。结果发现HPPM和EMP辐照后,心肌细胞搏动减慢,形态异常,活力下降,凋亡和坏死率明显增加。细胞膜出现数量不等、大小不一的电穿孔,细胞膜通透性丧失,结构破坏,细胞培养液中Na 、K 、Ca2 、Cl-、Mg2 、Ca2 和无机磷离子浓度显著升高(P<0.01),细胞内Ca2 浓度显著降低(P<0.01)。结果提示心肌细胞是电磁辐射损伤的敏感细胞,脉冲电磁场可致心肌细胞膜电穿孔,细胞形态、结构和功能均受到严重损伤。电穿孔效应是解释电磁辐射非热效应的关键机制之一。电穿孔导致的细胞膜通透性和膜结构改变存在一定发展规律。     

转化生长因子β-1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究

目的添加转化生长因子_1β(TGF_β1)以及与内脏内胚层样END_2细胞共培养,定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化,探索联合使用化学诱导法与共培养法对ESCs的心肌细胞定向诱导分化作用。方法将ESCs悬浮培养形成2~3 d类胚体(EBs),再向培养液内添加TGF_β1,或(和)将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养。自然分化为对照组。免疫荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(α_actin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果向培养液添加TGF_β1或将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养,各自有(43±2.08)%(P<0.01),(69±3.61)%(P<0.01),(65±3.06)%(P<0.01)的EBs出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白α_Actin和TnT,观察到心肌样超微结构。自然分化组发生自发节律性收缩的EBs只有(12±1.53)%,尤其是联合使用两种诱导方法,自发性收缩的EBs高达(91±1.52)%(P<0.01),收缩区域较单一诱导组大,且细胞形态较单一。结论联合使用化学诱导和共培养2种诱导法对ESCs的心肌细胞定向分化有协同作用。     

TGF-β1联合内脏内胚层END-2细胞诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞及与凋亡的关系

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化过程中分化与凋亡的关系,为优化组织工程的种子细胞提供依据。方法:先将ESCs悬浮培养形成2-3 d拟胚体(embryoid bodies,EBs),再向培养液中添加转化生长因子-β1(TGF-β1),以及与内脏内胚层样END-2细胞条件培养液共培养联合诱导ESCs向心肌细胞分化。以自然分化为对照组。激光共聚焦显微技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。用AnnexinⅤ/PI双染后,在流式细胞仪上检测ESCs分化过程中的凋亡情况。结果:EBs经TGF-β1诱导后,有(43.00±2.08)%的拟胚体出现自发节律性收缩,表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构,尤其是联合TGF-β1和END-2细胞条件培养液诱导,自发性收缩的拟胚体高达(88.00±1.42)%(P<0.01),收缩区域较大且拥有较成熟的心肌样结构。然而自然分化组发生自发节律性收缩的拟胚体只有(12.00±1.53)%。经2种诱导条件诱导后,检测两者的凋亡率分别为(5.58±0.65)%,(9.60±0.75)%(P<0.05)。结论:联合TGF-β1和内脏内胚层样END-2细胞条件培养液对心肌细胞分化有较高的诱导率,两者发挥协同诱导作用,可能机制是直接诱导ESCs分化或促进不向心肌细胞分化的ESCs凋亡。     

Simultaneous recording of ATP-sensitive K+ current and intracellular Ca2+ in anoxic rat ventricular myocytes. Effects of glibenclamide

We investigated the temporal relationship between the adenosine triphosphate-sensitive K current (K _ATP current), hypoxic shortening and Ca accumulation in cardiomyocytes exposed to anoxia or metabolic inhibition. Whole-cell, patch-clamp experiments were performed with nonstimulated isolated rat heart ventricular muscle cells loaded with the Ca-sensitive fluorescent dye 1-[2-(5-carboxyoxazol-2-yl)-6-aminobenzofuran-5-oxy]-2-(2′-amino-5′-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (fura-2) via the patch pipette. After approximately 8 min anoxia, the K _ATP current started to rise and reached a maximum of 21.3 ± 3.7 nA (n = 5, recorded at 0 mV clamp potential) within 1–3 min. At that time hypoxic contracture also occurred. Resting cytoplasmic free calcium (Ca_i) did not change significantly before hypoxic shortening. After hypoxic contracture, the K _ATP current decreased and Ca_i started to rise, reaching about 1 μmol/l. The presence of glibenclamide (10 μmol/l) in the bath reduced the anoxia-induced K _ATP current by more than 50%, but did not significantly influence the time dependence of current, hypoxic shortening and Ca_i, or the magnitude of Ca_i. Metabolic inhibition with 1.5 mmol/l CN resulted in K _ATP current increase and hypoxic shortening, occurring somewhat earlier than under anoxia, but all other parameters were comparable. In non-patch-clamped cells loaded with fura-2 AM ester and field-stimulated with 1 Hz, 1 μmol/l glibenclamide had no significant effect on the magnitude of the Ca_i increase caused by exposure of the cells to 1.5 mmol/l CN⁻. After CN⁻ wash-out in non-patch-clamped cells, Ca_i declined, oscillated and finally returned to control values. It can be concluded that glibenclamide inhibits anoxia-induced K _ATP currents only partially and has no significant effect on anoxia-induced rise in resting Ca_i. Received: 3 November 1995/Received after revision: 9 January 1996/Accepted: 16 January 1996     

构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究

探索神经生长因子诱导的交感神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌组织神经支配研究模型的可行性。用含0.04?TA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与NGF诱导的交感神经元样PC12细胞在液态的Ι型胶原中共培养,通过光学显微镜观察、常规H.E.染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对其进行评价。在三维共培养模型中,NGF诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起,突起及其上的膨体能够到达跳动的心肌细胞表面,神经突起随心肌细胞一起跳动。说明采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的,神经细胞与心肌细胞可能有支配关系。     

银杏叶提取物对小鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响

目的 探讨银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, EGb)对缺氧/复氧所致心肌细胞氧化应激损伤的保护作用.方法 将原代大鼠心肌细胞分为空白对照组(Con组)、高剂量EGb对照组(C160组)、缺氧/复氧组(H/R组)、低剂量EGb组(EGb40组)、中剂量EGb组(EGb80组)、高剂量EGb组(EGb160组).采用四唑盐(MTT)法检测各组细胞活力,采用酶联免疫吸附法检测各组细胞的MDA含量、SOD活力、GSH与GSSG含量,并计算GSH/GSSG比值以及GSH/GSSG氧化还原电势(Eh(GSH/GSSG)).结果 与Con组相比,H/R组的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)升高(P<0.01),细胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力降低(P<0.01).EGb40、EGb80和EGb160组的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)较H/R组降低(P<0.01),细胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力升高(P<0.01),且呈浓度依赖性(P<0.01).结论 EGb具有明显的抗氧化应激能力,EGb预处理可明显衰减H/R心肌细胞所受的氧化损伤.     

硫喷妥钠调控miR 664 1 5p对氯化钴诱导的心肌细胞缺氧损伤的保护作用

【摘要】目的 研究硫喷妥钠对氯化钴（CoCl2）诱导的大鼠心肌细胞H9c2缺氧损伤的保护作用及潜在机制。方法 对H9c2细胞进行CoCl2处理建立缺氧损伤模型（模型组）,分别采用125、250、500 nmol/L的硫喷妥钠处理600 μmol/L CoC2的DMEM培养液培养H9c2细胞,分别记为药物1、2、3组,对照组为不含CoCl2的DMEM培养液培养H9c2细胞。CCK8法和流式细胞术分别检测细胞存活率和凋亡率,Western blot测定P21和Caspase 3蛋白水平,分光光度法测定H9c2细胞中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性,qRT PCR检测CoCl2诱导后H9c2细胞miR 664 1 5p的表达水平。结果 与对照组相比,模型组心肌细胞H9c2中MDA、P21和Caspase 3含量升高,细胞存活率降低,凋亡率升高,miR 664 1 5p含量和SOD活性均降低,差异均具有统计学意义（均P＜005）;与模型组相比,药物2组和药物3组H9c2细胞中MDA、P21和Caspase 3含量降低,细胞存活率升高,凋亡率降低,miR 664 1 5p含量和SOD活性均上升,差异均具有统计学意义（均P＜005）;过表达miR 6641 5p可抑制CoCl2诱导的H9c2细胞凋亡,提高细胞存活率;抑制miR 664 1 5p能减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞缺氧损伤的保护作用。结论硫喷妥钠通过miR 664 1 5p提高CoCl2诱导的大鼠心肌细胞H9c2存活率,抑制细胞凋亡,减轻细胞损伤。     

MEF2C介导microRNA-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用

目的:研究微小RNA-214(mi R-214)对心肌细胞肥大的调控作用及其可能的作用靶基因。方法:建立血管紧张素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)诱导的C57BL/6乳小鼠心室肌细胞肥大模型;双萤光素酶报告基因实验检测mi R-214与潜在靶基因MEF2C 3’端非翻译区(3’UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测MEF2C及肥厚标志物的m RNA和蛋白表达水平。结果:心肌肥厚标志物ANP、ACTA1和β-MHC,以及mi R-214的表达在Ang-II诱导肥大的小鼠心肌细胞中显著增强;双萤光素酶报告基因实验提示mi R-214与MEF2C 3’UTR相互作用,证实mi R-214可在转录水平抑制MEF2C的表达,MEF2C蛋白水平在肥大的心肌细胞中显著上调;过表达mi R-214及沉默MEF2C均能一致性地抑制Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞中肥大标志物的表达。结论:MEF2C是mi R-214的靶基因,并介导了mi R-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用。