Inhibition of NMDA-induced protein kinase C translocation by a Zn chelator: Implication of intracellular Zn

The role of intracellular Zn²⁺ in the translocation of protein kinase C from cytosol to membrane fractions was examined by the [³H]phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) binding method in guinea pig cerebral synaptoneurosomes. N-methyl-d-aspartate (NMDA, 100 μM) and calcium ionophore A23187 (0.3–30 μM) decreased the binding activity in the cytosol with a concomitant increase in the membrane fractions. Pretreatment of synaptoneurosomes with a heavy metal chelator, N,N,N′,N′-tetrakis-(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN), inhibited the NMDA- and A23187-induced changes of the distribution of [³H]PDBu binding sites in cytosol and membrane fractions. The inhibitory effect of TPEN was negated by a preincubation of TPEN with equimolar Zn²⁺ but not by that with Ca²⁺. The addition of 500 μM Zn²⁺ to the lysate of synaptoneurosomes induced an increase of [³H]PDBu binding activity in the membrane fraction with a concomitant decrease in the cytosol fraction, as did 100 μM Ca²⁺. Low concentrations of Zn²⁺ (10 μM), which alone had no effect on the distribution of the binding, significantly enhanced the effect of 10 μM Ca²⁺ in the lysate. Under those conditions TPEN inhibited the Zn²⁺-potentiated Ca²⁺-dependent changes in the binding. These results suggest that intracellular Zn²⁺ is essential for the agonist-induced translocation of protein kinase C in guinea pig synaptoneurosomes.     

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的构建pCool—GST—ICAD／CAD的表达载体，并存大肠杆菌BL21（DE3）中表达具有生物学活性的CAD核酸酶？方法用PCR扩增CAD基因，将扩增产物克隆入pCool—GST—ICAD载体中构建出pCool—GST—ICAD／CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化。最后用SDS—PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool—GST—ICAD／CAD原核表达载体，重组载体转化后表达出毫克级水平的GST—ICAD／CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD—ICAD篮白复合体，在SDS—PAGE电泳上旱现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶，为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。     

9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

GPC3在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的 探讨GPC3在卵巢癌中的表达及其临床意义.方法 利用实时荧光定量RT-PCR技术检测2004年1月～2005年10月手术获得的35例卵巢上皮性癌组织及23例正常卵巢组织中GPC3 mRNA的表达量,并结合卵巢癌的临床病理特点进行分析.利用Western blot技术检测4例卵巢癌组织和3例正常卵巢组织中GPC3蛋白的表达水平.结果 GPC3 mRNA在卵巢癌组织中的表达量低于正常卵巢组织(P＜0.05),部分卵巢癌组织无GPC3 mRNA表达.GPC3 mRNA的表达量与卵巢癌临床分期有关,在Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌组织中的表达量显著低于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05).GPC3 mRNA与CA125在卵巢癌中的表达无相关性(P＞0.05).GPC3蛋白在正常卵巢组织中的表达水平是卵巢癌组织中的2～3倍.结论 GPC3在卵巢癌的发生发展中起着一定作用,其与CA125联合应用有可能提高卵巢癌的阳性诊断率.     

电针镇痛的累积效应与大鼠下丘脑、海马蛋白激酶A表达变化的观察

目的:观察电针(EA)"足三里"-"阳陵泉"镇痛的累积效应,及大鼠下丘脑和海马细胞蛋白激酶A(PKA)活性的变化。方法:Wistar雌鼠68只,随机分为正常对照组、慢性压迫损伤(CCI)组、CCI+EA 2天(d)组、CCI+EA 2周(w)组、去卵巢(OVX)+CCI组、OVX+CCI+EA 2 d组、OVX+CCI+EA 2 w组。Morris水迷宫法检查OVX+D-半乳糖皮下注射动物的学习记忆能力。结扎坐骨神经造成CCI慢性痛模型,电针双侧"足三里"-"阳陵泉"穴(2/15 Hz,1~2 mA,1次/d)。用辐射热照射大鼠双侧足底引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应;用免疫组化法检测下丘脑和海马组织PKA的活性。结果:CCI术后,与正常组比较,各组HS都明显升高。在单纯CCI动物上,与CCI组比,CCI术后第18天CCI+EA 2 d、CCI+EA 2 w的HS显著减小(P<0.05);CCI+EA 2 w组的HS显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05)。在记忆损害的动物上,OVX+CCI+EA 2 w和OVX+CCI+EA 2 d组HS明显低于OVX+CCI组(P<0.05);而两EA组间HS差异没有显著性意义(P>0.05)。CCI+EA 2 w组下丘脑室旁核(PVN)、弓状核(ARC)和视上核(SON)区PKA的灰度值均明显低于正常对照组(P<0.05),PVN和ARC区也显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05);OVX+CCI+EA 2 w组PVN和SON区的PKA灰度值亦均明显低于OVX+CCI组(P<0.05)。说明EA 2 w可上调PKA的表达,且具有累积性作用。OVX+CCI+EA 2 w组ARC和SON区PKA的灰度值均显著高于CCI+EA 2 w组(P<0.05),提示EA上调PKA表达的累积效应在记忆功能减退的动物上明显减弱。海马PKA的表达与SON等下丘脑核团PKA的表达趋势类似。结论:电针镇痛有累积作用,其累积效应可能与下丘脑、海马细胞PKA的表达上调有关,并且与动物神经记忆有密切关系。     

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

Recombinant glycoprotein based vaccine for Chandipura virus infection

Chandipura virus (CHPV) has emerged as an important pediatric encephalitis-causing pathogen with very high mortality in India. No specific vaccine or treatment is available till date. We attempted to prepare a candidate vaccine employing recombinant CHPV Glycoprotein (rGp). The Glycoprotein gene (G-gene) of CHPV was expressed using Baculovirus expression system. The rGp was purified by HPLC and used for mice immunization, 3 doses, and 4 weeks apart. One microgram rGp was found to be optimum. Sero-conversion was observed as early as 2nd week by detecting anti-CHPV IgG antibodies. Antibody titres were immunogen-concentration dependent. Intracerebral challenge of the immunized mice with 100 LD₅₀ of the homologous strain demonstrated 90% protection. In in vitro neutralization, antibodies from the immunized mice were able to neutralize heterologous viruses. There was 60% T cell proliferation observed against rGp in immunized mice. The study shows that rGp induces both arms of immune response and represents an ideal vaccine candidate for further evaluations.     

胰腺癌中p16基因甲基化改变及其蛋白表达分析

目的:探讨胰腺癌与癌旁组织中p16基因启动子区异常甲基化的改变及其蛋白表达的特点,以及其与胰腺癌发生发展的关系。方法:分别采用免疫组化SP法及甲基化特异PCR(MSP)检测46例人胰腺癌和癌旁组织中p16基因表达及其甲基化的水平,并结合临床资料进行分析。结果:胰腺癌中p16蛋白表达率为41.3%(19/46),而癌旁组织表达率为95.7%(44/46),两者有差异显著性(P<0.01)。p16蛋白阳性的19例胰腺癌标本中均未检出基因甲基化;p16蛋白缺失的27例标本中有18例检出基因甲基化,甲基化率为39.1%。p16基因甲基化与蛋白缺失有明显关系(P<0.05)。p16基因表达及其启动子区甲基化的发生率与胰腺癌的大小,患者性别﹑年龄的差异无显著意义(P>0.05),但与组织分化程度﹑淋巴结转移﹑PTNM分期有显著意义(P<0.05)。结论:p16基因启动子的异常甲基化可影响p16蛋白的表达,它们与胰腺癌的发生发展有关;p16甲基化和蛋白表达可能成为胰腺癌诊断及预后的候选标志物之一。