蟾毒灵抑制胆总管癌细胞QBC-939增殖和诱导凋亡的实验研究

目的观察蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖和凋亡的影响,以及凋亡相关蛋白表达量的变化。方法体外培养人胆管癌QBC-939细胞,运用MTT检测蟾毒灵对胆管癌细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测蟾毒灵对胆管癌细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响;并采用Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase3、激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)和Cleaved-PARP的表达量变化。结果蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖具有明显抑制作用,在一定浓度下表现出时间、剂量依赖性。流式细胞仪检测显示:细胞的凋亡率明显增加;线粒体膜电位随蟾毒灵浓度增加,膜电位发生下调。Western blotting结果显示:蟾毒灵处理QBC-939细胞48h后,Caspase3蛋白被剪接活化,激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)表达量升高;同时,Caspase3的作用底物多聚聚合酶PARP的降解产物(Cleaved-PARP)表达明显升高,且呈浓度依赖性。结论蟾毒灵能够明显抑制人胆管癌QBC-939细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖性;线粒体凋亡途径在蟾毒灵的抗癌过程中发挥了作用。     

XAV-939对三阴性乳腺癌抑制的作用

目的:探索XAV-939对三阴性乳腺癌的生长产生抑制作用及其机制.方法:体外检测XAV-939对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用,并检测Axin 1、Axin 2、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达以及VEGF-A的分泌水平.在体观察XAV-939对裸鼠移植瘤的体积和瘤重变化情况,并检测肿瘤组织中Axin 1、Axin 2、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达,以及VEGF表达、微血管密度、增殖指数及凋亡指数.结果:XAV-939可以抑制MDA-MB-231细胞的生长,其抑制作用呈浓度依赖型;同时XAV-939抑制了MDA-MB-231细胞分泌VEGF-A的能力.体内实验中,XAV-939可以明显抑制肿瘤组织生长;肿瘤组织的VEGF表达量下降,微血管密度下降;肿瘤组织的凋亡指数显著上升;增殖指数没有明显变化.体外体内实验均显示XAV-939处理组的Axin 1、Axin 2和p-β-catenin表达量明显上升而β-catenin显著下降.结论:XAV-939可以通过抑制Wnt/β-catenin通路在体内外抑制三阴性乳腺癌细胞/组织的增殖.     

Wnt通路抑制剂XAV-939对牙髓干细胞成脂分化的影响

目的：通过体外实验探讨Wnt通路抑制剂XAV?939对牙髓干细胞增殖及成脂分化的影响。方法酶消化法培养牙髓干细胞,鉴定后采用CCK8试剂盒检测XAV?939对牙髓干细胞增殖的影响,油红O染色检测XAV?939对牙髓干细胞成脂分化的影响,qRT?PCR检测成脂分化过程中,XAV?939对Wnt通路相关基因糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase?3β, GSK3β）和β?catenin以及成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator activated receptor?γ2, PPARγ2）和CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）的影响。结果牙髓干细胞成脂诱导14 d后,XAV?939上调GSK3β、PPARγ2和C/EBPα的表达,同时下调β?catenin的表达。结论 XAV?939可以通过抑制Wnt通路促进牙髓干细胞的成脂分化。     

XAV939对肝癌细胞增殖及糖酵解的影响

目的：探讨 Wnt／β－catenin 信号通路特异性抑制剂 XAV939对肝癌细胞增殖及糖酵解过程的影响。方法：MTT 方法检测不同浓度 XAV939对肝癌细胞 Bel －7402、HCCLM3增殖能力的影响;Western blot 方法检测 XAV939对肝癌 Bel －7402、HCCLM3细胞 Wnt／β－catenin 信号通路关键基因和其下游靶基因表达的影响,以及对糖酵解过程中关键调控基因表达的影响。运用 SPSS 19．0统计软件分析各组间的差异。结果：MTT 结果表明不同浓度的 XAV939能够不同程度的抑制 Bel －7402、HCCLM3细胞增殖能力,XAV939对两种细胞的抑制率接近50％时,浓度分别为：30μmol／L、20μmol／L。Western blot 结果显示,XAV939可以显著抑制 Wnt／β－catenin 及其下游基因 c －myc、Cyclin D1的表达,有效抑制β－catenin 信号通路活性;同时,XAV939可以通过抑制 HK －2、LDHA 而非 Glut －1的蛋白表达水平来抑制肝癌细胞的糖酵解过程。结论：XAV939在体外能够有效抑制肝癌细胞 Wnt／β－catenin 信号通路及其依赖性细胞增殖和糖酵解过程。     

circ_0000615通过靶向miR-432-5p调控胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的：探讨circ_0000615在胆管癌细胞中的表达及其对胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响和可能的调控机制。方法：通过 qPCR 检测 circ_0000615 在正常胆管上皮 HIBEC 细胞和胆管癌 CCLP-1、QBC939、TFK-1 和 RBE细胞中的表达水平。双荧光素酶报告基因 实 验 验 证 circ_0000615 与 miR-432-5p 的靶向关系。将 si-NC、si-circ_0000615（si-circ-1、si-circ-2）、inhibitor-NC 和 inhibitor-miR-432-5p 转染至 CCLP-1 和 QBC939 细胞 ,转染细胞分为 si-NC 组、si-circ-1 组、si-circ-2 组、si-NC+inh-NC组、si-NC+inh-miR-432-5p组和si-circ-1+inh-miR-432-5p 组,通过 CCK-8、EdU和Transwell实验 检 测 各 转染组胆管 癌 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果：在胆管癌细胞中 circ_0000615 呈高表达而 miR-432-5p 呈低表达（P<0.05或P<0.01）;双荧光素酶报告基因实验证实circ_0000615与miR-432-5p之间存在靶向关系（P<0.01）;敲减circ_0000615可明显抑制CCLP-1、QBC939 细胞的增殖、侵袭和迁移能力（P<0.05 或 P<0.01）;下调 miR-432-5p 可部分逆转敲减 circ_0000615 对胆管癌 CCLP-1 和QBC939细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。结论：circ_0000615通过靶向miR-432-5p调控胆管癌细胞的增殖、侵袭和迁移。     

XAV939, a tankyrase 1 inhibitior,promotes cell apoptosis in neuroblastoma cell lines by inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway

Background

Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. The present treatment including surgery, chemotherapy and radiation, which have only 40% long-term cure rates, and usually cause tumor recurrence. Thus, looking for new effective and less toxic therapies has important significance. XAV939 is a small molecule inhibitor of tankyrase 1(TNKS1). The objective of this study is to investigate the effect of XAV939 on the proliferation and apoptosis of NB cell lines, and the related mechanism.

Methods

In the present study, we used both XAV939 treatment and RNAi method to demonstrate that TNKS1 inhibition may be a potential mechanism to cure NB. MTT method was used for determining the cell viability and the appropriate concerntration for follow-up assays. The colony formation assay, Annexin V staining and cell cycle analysis were used for detecting colony forming ability, cell apoptosis and the percentage of different cell cycle. The Western blot was used for detecting the expression of key proteins of Wnt/ beta-catenin (Wnt/β-catenin) signaling pathway.

Results

The results showed that TNKS1 inhibition decreased the viability of SH-SY5Y, SK-N-SH and IMR-32 cells, induced apoptosis in SH-SY5Y as well as SK-N-SH cells, and led to the accumulation of NB cells in the S and G2/M phase of the cell cycle. Moreover, we demonstrated TNKS1 inhibition may in part blocked Wnt/β-catenin signaling and reduced the expression of anti-apoptosis protein. Finally, we also demonstrated that TNKS1 inhibition decreased colony formation in vitro.

Conclusions

These findings suggested that TNKS1 may be a potential molecule target for the treatment of NB.

     

Oddi括约肌成型术后患者胆汁促增殖活性的探讨

目的　观察经十二指肠Oddi括约肌成型术 (TS)后患者胆汁 (TSB)对人胆管癌细胞QBC 93 9生长的影响 ,探讨TS与胆管癌发生与发展的关系。方法　应用四唑蓝 (MTT)比色法检测 12份TSB和10份正常胆汁 (NB)对QBC93 9细胞增殖的影响 ,应用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果　TSB与NB比较 ,前者明显促进QBC 93 9细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ;TSB处理 2 4h的QBC93 9细胞增殖指数显著上升 (P <0 .0 5 )。结论　TSB具有潜在的促增殖活性 ,TS与胆管癌的发生与发展关系密切。     

肝母细胞瘤分子标志物检测、异体移植模型建立及靶向治疗

目的 检测中国肝母细胞瘤(HB)样本中Hippo及Wnt抑癌信号通路活化状态、构建肝母细胞瘤小鼠异体移植模型(PDX),并在此基础上检测候选药物疗效。方法 收集在复旦大学附属儿科医院病理确诊为HB患儿的肿瘤及瘤旁肝脏组织,通过免疫组化染色(IHC)检测组织中YAP和β-catenin(分别反映Hippo及Wnt通路活化状态)表达及亚细胞定位情况;利用HB细胞系HuH6,检测TNKS1/2抑制剂(XAV939)对YAP和β-catenin的抑制作用;构建HB小鼠PDX,并检测XAV939与其他候选药物对HB PDX生长的抑制效应。结果 在本组病例中,YAP和β-catenin在HB肿瘤组织中的表达较瘤旁组织显著上调(P＜0.05 )。在HuH6细胞系中,XAV939能够通过稳定AMOT和AXIN1/2进而抑制YAP和β-catenin的活性。在HB PDX动物实验中,顺铂及顺铂+XAV939可以显著抑制肿瘤的生长且作用相似,而XAV939单独作用于PDX时,未检测到明显的肿瘤抑制作用;相反,成人肝癌药物索拉菲尼能够显著抑制HB PDX的生长。结论 YAP和β-catenin在中国HB样本中同时被异常激活。然而在HB PDX模型中,相较于顺铂及索拉菲尼,TNKS1/2抑制剂未能显示明显的肿瘤抑制效应。因此,在HB中靶向Hippo和Wnt通路还需要更深入的研究。     

LPS对5-FU杀伤QBC939细胞影响的实验研究

目的 探讨LPS联合化疗药物5-FU对人胆管癌QBC939细胞生长和诱导细胞凋亡的影响。方法 四甲基唾哇蓝(MTT)试验检测LPS对5-FU抑制QBC939细胞增殖的影响, 流式细胞术观察LPS对5-FU诱导QBC939细胞凋亡的影响。结果 1MTT法检测显示5-FU对胆管癌细胞株QBC939杀伤作用明显, 但易出现耐药性, LPS可以增强5-FU后期杀伤作用, 能一定程度上防止耐药的出现;2流式细胞术结果显示化疗药物5-FU后能显著诱导QBC939细胞发生凋亡, 凋亡指数为11.50±2.15(P<0.05), 对照组为3.53±0.32, 加用LPS后, 能更明显地诱导凋亡, 凋亡指数达到26.50±3.12, 与单用加化疗药物5-FU比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LPS能增强5-FU对胆管癌细胞株QBC939的后期杀伤作用, LPS联合化疗药物可能是胆管癌临床治疗的一种合理策略。