构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

一套功能完善的档案信息库管理软件

检索字典式数据维护常见的档案信息数据库，通常用编码来代替人的各种信息存入计算机。这样的数据库存储着大量形形色色的代码。如：性别、籍贯、单位、文化程度、政治面貌、职务、职称等都用代码来替代文字。其弊端很多：①用户在输入信息数据之前，要用大量的时间来查找...     

用噬菌体表面展示技术筛选与肝癌细胞系结合的抗体模拟肽

目的:从噬菌体展示肽库中,筛选可与肝癌细胞特异性结合的抗体模拟肽。方法:通过生物淘选使噬菌体富集。利用ELISA法,鉴定噬菌体单克隆原种的亲和性,并进行统计学分析。通过竞争ELISA,分析筛选所得抗体模拟肽的结合位点,并进一步分析抗体模拟肽的序列组成。结果:随着淘选次数的增加,出现噬菌体的富集。ELISA的结果显示,相对于正常肝细胞,筛选所得环状7肽对肝癌细胞系SMMC7721和BEL7402均有良好的结合活性(P<0.05),且与SMMC7721细胞的结合活性明显优于与BEL7402细胞的亲和性(P<0.05)。在α=0.01的水平上,7肽单克隆噬菌体原种可明显与scFv竞争结合SMMC7721细胞(0.005相似文献   

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的?     

脑膜炎大肠埃希菌侵袭素IbeA结合多肽的初步研究

目的脑膜炎大肠埃希菌（E．coli）侵袭素IbeA通过与脑微血管内皮细胞表面受体结合，从而介导细菌穿透血脑屏障引起新生儿细菌性脑膜炎。为通过肽库筛选获得与IbeA蛋白结合的多肽，建立噬菌体随机肽库筛选IbeA结合多肽模体的方法。方法首先制备靶分子，用PCR扩增出全长ibeA基因序列，克隆至表达载体pET28a中，转化大肠埃希菌BL21（DE3）．经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白，经变性复性后通过Ni^2＋-NTA亲和层析柱得到纯度达90％的重组蛋白。然后以固相化IbeA重组蛋白为靶亲和筛选噬菌体线性12肽库。结果经过3轮淘选，得到能和IbeA结合的24个重组噬菌体克隆；挑选15个亲和力高的克隆进行DNA测序，对比分析所得的短肽序列。固相Fmoc法合成短肽，并进行结合实验、阻断实验和竞争抑制实验。绪论以重组表达的IbeA融合蛋白为靶筛选得到的重组噬菌体十二肽克隆，能够和IbeA蛋白结合，为IbeA蛋白结合多肽。结果提示所筛选的阳性噬菌体克隆及其合成肽可能模拟IbeA受体表位的结构。     

可与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体的表达及其特性

目的:在原核细胞中表达经噬菌体抗体库筛选可与HepG2细胞特异性结合的单链抗体(scFv),并对其特性进行鉴定。方法:采用正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,从人源噬菌体抗体库中筛选可与HepG2细胞特异结合的scFv。对scFv DNA测序后,以其阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在IPTG诱导下表达scFv并以金属离子螯和层析(IMAC)进行纯化,用100g/L SDS-PAGE、Western blot及ELISA分析纯化的scFv。将纯化的scFv与HepG2细胞共孵育后,观察其对细胞生长的影响。结果:经筛选获得的2个相对特异性的scFv,分别命名为SLH04及SLH10。经IPTG诱导获得可溶性scFv的表达。Western blot分析证明,表达产物的相对分子质量(Mr)均为36000左右,与理论预期值相符。ELISA检测表明,纯化的scFv能与HepG2细胞特异性结合,并抑制HepG2细胞的生长。结论:从人源噬菌体抗体库中,筛选出能与HepG2细胞特异性结合的scFv,并在大肠杆菌中表达,有望用于肝癌生物治疗的实验研究。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

应用噬菌体随机肽库技术筛选幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的抗原表位

目的 筛选和鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein,NAP)的有效抗原表位,为Hp疫苗的研制提供基础.方法 以抗NAP的单克隆抗体作为固相筛选分子,经3轮吸附-洗脱-扩增免疫,筛选噬菌体随机7肽库,随机挑选噬菌体克隆,经噬菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)、交叉反应试验及竞争抑制试验鉴定阳性克隆,测定阳性克隆所携带DNA序列并进行计算机辅助分析.以制备的阳性噬菌体克隆短肽液免疫小鼠,免疫血清与NAP经Western blot分析,以验证NAP的模拟表位.结果 经3轮免疫筛选后挑选到45个阳性克隆,经ELISA鉴定有12个阳性克隆,测序结果显示5种表位,其中P17噬菌体展示肽FAHLATQ与NAP氨基酸序列(137～143)高度同源,位于NAP高抗原区域(118～140),免疫血清可识别NAP.结论 用噬菌体随机7肽库成功筛选到了NAP的模拟表位,为基于NAP的诊断和疫苗的研制提供了基础.     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。